CHƯƠNG 3 : PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5 Định lượng polyphenol bằng phương pháp đo quang
3.5.1 Nguyên tắc
Phương pháp đo quang sử dụng thuốc thử Folin-Ciocalteu được sử dụng để xác định hàm lượng polyphenol toàn phần. Thuốc thử Folin-Ciocalteu là một hỗn hợp với thành phần chính gồm phosphomolybdate và phosphotungstate là các tác nhân khử có màu vàng, sẽ được oxy hóa khi có mặt phenol và polyphenol để hình thành phức hợp màu xanh phosphotungstic-phosphomolybdenum có độ hấp thu quang phổ mạnh ở 765 nm [77]. Độ hấp thu của phức hợp này phụ thuộc vào môi trường kiềm nhẹ và nồng độ của các hợp chất phenol và polyphenol, vì thế Na2CO3 được thêm vào hỗn hợp để tạo môi trường kiềm nhẹ. Hàm lượng polyphenol toàn phần trong cao chiết được xác định dựa vào phương trình đường chuẩn được dựng bởi đồ thị thể hiện sự liên quan giữa giá trị OD và nồng độ chất chuẩn với chất chuẩn là gallic acid. Hàm lượng polyphenol tổng được biểu thị bằng mg gallic acid đương lượng/trọng lượng bột khô (mg GAE/g DPW).
3.5.2 Chuẩn bị hóa chất
Dung dịch thuốc thử: Pha dung dịch Folin-Ciocalteu 10% được pha bằng nước cất và bảo quản trong tối.
Dung dịch Na2CO3 10%: 10 g Na2CO3 hịa tan hồn tồn trong 20 mL nước cất sau đó cho vào bình, định mức đến vạch.
Dung dịch chuẩn gallic acid: Cân chính xác khoảng 0,1 gam chất chuẩn gallic acid, hịa tan trong các dung mơi và pha loãng thành 100 mL thu được dung dịch chuẩn gốc gallic acid nồng độ 1000 µg/ml. Sau đó lần lượt hút 1, 2, 3, 4 và 5 ml dung dịch chuẩn gốc gallic acid và pha loãng thành 100 mL để thu được các dung dịch gallic acid có nồng độ 10, 20, 30, 40 và 50 µg/ml, dùng cho các thí nghiệm.
3.5.3 Tiến hành thí nghiệm 3.5.3.1 Xây dựng đường chuẩn 3.5.3.1 Xây dựng đường chuẩn
Thêm 2,5 mL Folin-Ciocalteu 10% vào 0,5 mL dung dịch gallic acid. Ủ 3-8 phút ở 25℃, sau đó thêm vào hỗn hợp 2 mL dung dịch Na2CO3 10%. Ủ hỗn hợp 1 giờ trong bóng tối, sau đó đo mật độ hấp thụ quang phổ ở bước sóng cực đại 765 nm. Phương trình đường chuẩn tuyến tính được xây dựng dựa vào độ hấp thu quang phổ của dung dịch và dãy nồng độ của gallic acid (0, 2, 4, 6, 8, 10 µg/mL). Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
3.5.3.2 Xác định hàm lượng polyphenol
Một gram bột dược liệu khô được tiến hành chiết xuất như quy trình đã trình bày, thu lấy dịch chiết. Cô quay thu hồi dung môi, pha dịch chiết thành 100 mL trong dung môi chiết. Sau đó, 2,5 mL Folin-Ciocalteu 10% được thêm vào 0,5 mL dịch chiết. Ủ 3-8 phút ở 25℃, sau đó thêm vào hỗn hợp 2 mL dung dịch Na2CO3 10%. Ủ hỗn hợp 1 giờ trong bóng tối, sau đó đo mật độ hấp thụ quang phổ ở bước sóng cực đại 765 nm. Tiến hành song song với mẫu trắng. Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
Hàm lượng polyphenol tổng theo chất khơ trong mẫu phân tích được tính theo cơng thức (3.2):
Hàm lượng polyphenol tổng = Cthực. V. k. 1000
m x100 (3.2)
Trong đó: Cthực: nồng độ polyphenol tồn phần trong dung dịch thử (µg/ml) V: thể tích dung dịch thử (ml)
k: hệ số pha loãng
m: khối lượng bột dược liệu (g)