độ phòng trong 3-5 ngày. Dung dịch sau thẩm phân được ly tâm tại 10 000 vòng/phút, 4℃ trong 30 phút để loại tạp. Cuối cùng, dung dịch fibroin tơ tằm được đông khô bằng máy đông khô tại nhiệt độ -55℃ và áp suất 10-4 Torr. Fibroin đông khô được bảo quản lạnh để sử dụng cho các thí nghiệm sau.
3.4 Phương pháp định tính thành phần hóa học 3.4.1 Chuẩn bị dịch chiết 3.4.1 Chuẩn bị dịch chiết
Tiến hành định tính theo quy trình phân tích thành phần hóa thực vật đã được cải tiến và sửa đổi từ quy trình phân tích của Ciuley (Trường Đại học Dược khoa Bucarest, Rumani) nhằm xác định các hợp chất có trong các dịch chiết MeOH, EtOH 96% và EtOH 60% để đánh giá sơ bộ thành phần hóa học hoa Sài đất ba thùy [156].
Mỗi 2 g bột dược được chiết tương tự với các dung môi tương tự như quy trình chiết cao đã nêu ở trên. Dịch chiết được cơ quay đến cịn khoảng 20 mL.
3.4.2 Khảo sát sự hiện diện của các nhóm hợp chất có trong các loại cao chiết 3.4.2.1 Khảo sát sự hiện diện của alkaloid 3.4.2.1 Khảo sát sự hiện diện của alkaloid
Lấy khoảng 5 mL dịch chiết cho vào chén sứ, bốc hơi tới cắn. Hòa cắn trong 4 mL dung dịch HCl 5%. Chia dung dịch acid vào 4 ống nghiệm nhỏ. Thực hiện định tính alkaloid bằng các thuốc thử Wagner.
So sánh kết quả với ống nghiệm đối chứng khơng có thuốc thử, nếu dung dịch đục hoặc có tủa: Có alkaloid.
3.4.2.2 Khảo sát sự hiện diện của flavonoid
Lấy khoảng 3 mL dịch chiết cho vào 1 ống nghiệm lớn. Thêm vào vài giọt dung dịch NaOH loãng. Dung dịch sẽ chuyển sang màu vàng. Thêm vài giọt H2SO4 loãng, màu vàng sẽ biến mất hoặc khơng màu. Chứng tỏ có sự hiện diện của flavonoid.
a. Tác dụng với dung dịch NaOH 1%/EtOH
Nhỏ 0,5 mL dung dịch NaOH 1%/EtOH vào 3 mL dung dịch cao chiết. Sẽ có màu từ vàng-cam-đỏ. Nếu là flavon, isoflavon, flavanon, chalcon, leucoanto- cyanydin sẽ có màu vàng; flavonol cho màu từ vàng đến cam; auron cho màu đỏ đến đỏ tím.
b. Tác dụng với dung dịch H2SO4 đậm đặc
Nhỏ 0,5 mL dung dịch H2SO4 đậm đặc vào 3 mL dung dịch cao chiết. Nếu có flavon và flavonol sẽ cho màu vàng đậm-cam và có phát huỳnh quang đặc biệt; chalcol và auron cho màu đỏ hoặc xanh dương-đỏ; flavanol cho màu cam đến đỏ.
3.4.2.3 Khảo sát sự hiện diện của saponin
Mỗi 3 mL được cho vào 2 ống nghiệm riêng biệt: Ống 1: 5 mL HCl 0,1N (pH=1) + 3 giọt dung dịch thử. Ống 2: 5 mL NaOH 0,1N (pH=13) + 3 giọt dung dịch thử.
Bịt miệng ống lắc mạnh trong 1 phút, để yên, quan sát các cột bọt bong bóng trong cả 2 ống nghiệm. Nếu cột bọt cả 2 ống nghiệm bằng nhau và bọt có độ bền như nhau, có thể có saponin triterpen. Nếu ống pH 13 có cột bọt cao hơn nhiều so với ống pH 1 có thể có saponin steroid.
3.4.2.4 Khảo sát sự hiện diện của các chất khử
Nhỏ 0,5 mL dung dịch thuốc thử Tollens vào 3 mL dung dịch cao chiết. Sẽ có hiện tượng bạc bám vào thành ống nghiệm hoặc kết tủa đen nếu có đường khử.
3.4.2.5 Khảo sát sự hiện diện của các acid hữu cơ
Lấy 2 mL dịch chiết cho vào một ống nghiệm. Thêm vào dung dịch một ít tinh thể Na2CO3. Nếu có các bọt khí nhỏ sủi lên từ các tinh thể Na2CO3: Có acid hữu cơ.
3.5 Định lượng polyphenol bằng phương pháp đo quang 3.5.1 Nguyên tắc 3.5.1 Nguyên tắc
Phương pháp đo quang sử dụng thuốc thử Folin-Ciocalteu được sử dụng để xác định hàm lượng polyphenol toàn phần. Thuốc thử Folin-Ciocalteu là một hỗn hợp với thành phần chính gồm phosphomolybdate và phosphotungstate là các tác nhân khử có màu vàng, sẽ được oxy hóa khi có mặt phenol và polyphenol để hình thành phức hợp màu xanh phosphotungstic-phosphomolybdenum có độ hấp thu quang phổ mạnh ở 765 nm [77]. Độ hấp thu của phức hợp này phụ thuộc vào môi trường kiềm nhẹ và nồng độ của các hợp chất phenol và polyphenol, vì thế Na2CO3 được thêm vào hỗn hợp để tạo môi trường kiềm nhẹ. Hàm lượng polyphenol toàn phần trong cao chiết được xác định dựa vào phương trình đường chuẩn được dựng bởi đồ thị thể hiện sự liên quan giữa giá trị OD và nồng độ chất chuẩn với chất chuẩn là gallic acid. Hàm lượng polyphenol tổng được biểu thị bằng mg gallic acid đương lượng/trọng lượng bột khơ (mg GAE/g DPW).
3.5.2 Chuẩn bị hóa chất
Dung dịch thuốc thử: Pha dung dịch Folin-Ciocalteu 10% được pha bằng nước cất và bảo quản trong tối.
Dung dịch Na2CO3 10%: 10 g Na2CO3 hịa tan hồn tồn trong 20 mL nước cất sau đó cho vào bình, định mức đến vạch.
Dung dịch chuẩn gallic acid: Cân chính xác khoảng 0,1 gam chất chuẩn gallic acid, hịa tan trong các dung mơi và pha loãng thành 100 mL thu được dung dịch chuẩn gốc gallic acid nồng độ 1000 µg/ml. Sau đó lần lượt hút 1, 2, 3, 4 và 5 ml dung dịch chuẩn gốc gallic acid và pha loãng thành 100 mL để thu được các dung dịch gallic acid có nồng độ 10, 20, 30, 40 và 50 µg/ml, dùng cho các thí nghiệm.
3.5.3 Tiến hành thí nghiệm 3.5.3.1 Xây dựng đường chuẩn 3.5.3.1 Xây dựng đường chuẩn
Thêm 2,5 mL Folin-Ciocalteu 10% vào 0,5 mL dung dịch gallic acid. Ủ 3-8 phút ở 25℃, sau đó thêm vào hỗn hợp 2 mL dung dịch Na2CO3 10%. Ủ hỗn hợp 1 giờ trong bóng tối, sau đó đo mật độ hấp thụ quang phổ ở bước sóng cực đại 765 nm. Phương trình đường chuẩn tuyến tính được xây dựng dựa vào độ hấp thu quang phổ của dung dịch và dãy nồng độ của gallic acid (0, 2, 4, 6, 8, 10 µg/mL). Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
3.5.3.2 Xác định hàm lượng polyphenol
Một gram bột dược liệu khơ được tiến hành chiết xuất như quy trình đã trình bày, thu lấy dịch chiết. Cơ quay thu hồi dung môi, pha dịch chiết thành 100 mL trong dung mơi chiết. Sau đó, 2,5 mL Folin-Ciocalteu 10% được thêm vào 0,5 mL dịch chiết. Ủ 3-8 phút ở 25℃, sau đó thêm vào hỗn hợp 2 mL dung dịch Na2CO3 10%. Ủ hỗn hợp 1 giờ trong bóng tối, sau đó đo mật độ hấp thụ quang phổ ở bước sóng cực đại 765 nm. Tiến hành song song với mẫu trắng. Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
Hàm lượng polyphenol tổng theo chất khơ trong mẫu phân tích được tính theo cơng thức (3.2):
Hàm lượng polyphenol tổng = Cthực. V. k. 1000
m x100 (3.2)
Trong đó: Cthực: nồng độ polyphenol tồn phần trong dung dịch thử (µg/ml) V: thể tích dung dịch thử (ml)
k: hệ số pha loãng
m: khối lượng bột dược liệu (g)
3.6 Phương pháp bào chế hệ vi hạt fibroin
3.6.1 Bào chế hệ vi hạt fibroin trống (FMPs-Blank)
Cân bột khô fibroin lần lượt các khối lượng 0,055 g / 0,11 g / 0,165 g hòa tan trong 5 mL nước cất, vortex 2 phút, được các dung dịch fibroin 1%, 2% và 3%. Sau đó ly tâm 4000 vịng/phút trong 5 phút, hút lấy 2 mL dung dịch trong. Nhỏ từ từ 1 mL dung môi (MeOH, EtOH 60%, EtOH 96%) vào 2 mL dịch fibroin trong nước, lắc trong 1 giờ. Bảo quản ở nhiệt độ 4℃ trong thời gian 24 giờ. Sau đó, ly tâm 6 000 vòng/phút trong 40 phút, loại bỏ phần nổi phía trên thu được FMPs-Blank. Phần cắn được đông khô và bảo quản ở nhiệt độ 4℃ cho đến khi thực hiện thí nghiệm tiếp theo.
3.6.2 Bào chết hệ vi hạt fibroin được tải dịch chiết (FMPs-WT)
Việc điều chế hạt FMPs có chứa polyphenol từ chiết xuất hoa WT được thực hiện tương tự như hạt FMPs-Blank. Tuy nhiên, sẽ thay thế 1 mL dung môi bằng
1 mL dung dịch cao chiết. Pha cao chiết khô bằng các dung môi chiết, định lượng lại hàm lượng polyphenol và pha loãng lại để được dung dịch cao chiết có nồng độ polyphenol lần lượt là 7/10/10 mg đối với cao chiết MeOH, EtOH 60%, EtOH 96%. Sau đó nhỏ từ từ vào 2 mL dịch fibroin trong nước, lắc trong 1 giờ. Bảo quản ở nhiệt độ 4℃ trong thời gian 24 giờ. Sau đó, ly tâm 6 000 vịng/phút trong 40 phút, phần dịch trong được sử dụng để xác định lại hàm lượng polyphenol tự do còn lại. Phần cắn được đông khô và bảo quản ở nhiệt độ 4℃ cho đến khi thực hiện thí nghiệm tiếp theo.
3.7 Phương pháp xác định một số tính chất lý hóa của hệ vi hạt
3.7.1 Xác định hàm lượng polyphenol được tải vào hạt và khả năng tải của hệ vi hạt hệ vi hạt
Hàm lượng polyphenol được tải vào hạt được xác định bằng phương pháp đo quang phổ UV-Vis. Xác định hàm lượng polyphenol trong dung dịch trước và sau khi được tải vào hệ vi hạt bằng phương pháp đo quang sau khi phản ứng với thuốc thử Folin-Ciocalteu, ở bước sóng cực đại 765 nm. Hàm lượng polyphenol tải được (EE%) và khả năng tải của hệ vi hạt (DL%) được tính theo cơng thức (3.3) và (3.4) [10]:
EE% =Hàm lượng trước khi nạp − Hàm lượng sau khi nạp
Hàm lượng trước khi nạp ∗ 100 (3.3)
DL% =Tổng hàm lượng polyphenol được tải vào hạt
Khối lượng hạt ∗ 100 (3.4)
3.7.2 Đo kích thước hệ vi hạt
Kích thước hạt trung bình và sự phân bố kích thước hạt (PI) được xác định bằng phương pháp tán xạ ánh sáng động (DLS) sử dụng máy phân tích MicroTrac S3500. Mẫu hạt FMPs và FMPs-WT đơng khơ trước đó được tái phân bố lại trong 5 mL nước DI và phép đo được thực hiện ở 25℃ ở một góc cố định là 90° [143].
3.7.3 Xác định khả năng giải phóng polyphenol của hệ vi hạt
Khả năng giải phóng polyphenol trong vi hạt FMPs-WT được thực hiện bằng phương pháp lắc. Mẫu hạt được phân tán trong 50 mL dung dịch đệm phosphate (pH=7,4) với tốc độ 200 vòng/phút trong thời gian 2,5 giờ. Tại mỗi thời điểm 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240 phút, 1 mL mẫu được rút ra và cùng một lượng đệm được thêm vào. Mẫu được ly tâm ở 18 000 vòng/phút trong 5 phút [15, 91]. Hàm lượng polyphenol trong phần dịch sau ly tâm được xác định bằng phương pháp đo quang sau khi phản ứng với thuốc thử Folin-Ciocalteu, ở bước sóng 765 nm. Để xác định hàm lượng polyphenol trong dung dịch đệm phosphate, đường chuẩn được xây dựng trong khoảng nồng độ 2-10 µg/mL, y = ax + b. Cuối cùng, phần trăm tích lũy giải phóng (%T) được tính theo công thức (3.5):
% T = CtV0+ V ∑ Ci t−1 1
Trong đó: Ct, Ci: nồng độ của polyphenol được giải phóng tại thời điểm t và i V0: tổng thể tích dung dịch đệm giải phóng (50 mL)
V: thể tích mẫu rút tại mỗi thời điểm (1 mL) M0: lượng polyphenol ban đầu
Mi: tổng lượng polyphenol rút tại thời điểm i
3.7.4 Đánh giá tương tác của hệ vi hạt và các hợp chất trong dịch chiết
Đánh giá sự tương tác giữa fibroin và dịch chiết dựa vào phổ FT-IR của các mẫu FMPs, FMPs-WT và các cao chiết được, phổ thu được bằng máy quang phổ FT/IR 6300 (Jasco-Nhật Bản, dải tần từ 4000 đến 400 cm-1) với phương pháp viên KBr. Các phân tích được thực hiện trong điều kiện lọc khơng khí khơ với bộ mã hóa 256 hình ảnh giao thoa được thu thập ở độ phân giải 4.0 cm-1 [10, 91].
Các mũi tín hiệu amide I và amide II được sử dụng để xác định độ kết tinh của hệ vi hạt. Độ kết tinh sẽ được xác định dựa trên công thức (3.6) và (3.7):
CIIRI = D1626 / (D1626 + D1655) (3.6)
CIIRII = D1525 / (D1525 + D1557) (3.7)
CIIRI và CIIRII là các giá trị CI được tính tốn từ mật độ quang học của các dải amide đối với amide I và II tương ứng; D1626 và D1525 lần lượt là mật độ quang học của các phần tinh thể fibroin tại các amit I và II, trong khi D1655 và D1557 là mật độ quang học của các phần vơ định hình fibroin tại các amit I và II tương ứng.
3.8 Khảo sát khả năng quét gốc tự do DPPH của cao chiết và các hệ vi hạt 3.8.1 Nguyên tắc 3.8.1 Nguyên tắc
Hiệu quả quét gốc tự do DPPH của cao chiết hoa Sài đất ba thùy được thực hiện dựa theo phương pháp của Shekhar el al. (2014) có hiệu chỉnh [144].
DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) là gốc tự do ổn định, bền ở nhiệt độ thường, dạng bột màu đen ở điều kiện thường, có màu tím đặc trưng trong dung dịch. Gốc tự do DPPH có bước sóng hấp thu cực đại tại 519 nm và độ hấp thu của nó giảm tương ứng khi nguyên tử N mang một điện tử lẻ nhận một điện tử hydrogen từ các chất kháng oxy hóa (dung dịch chuyển từ đen tím sang vàng nhạt). Do đó, DPPH được sử dụng rộng rãi và là thử nghiệm cơ bản để đánh giá hiệu quả hoạt động quét gốc tự do của các chất kháng oxy hóa dựa trên sự thay đổi độ hấp thu của dung dịch DPPH ở 519 nm [145].
Hoạt tính quét gốc tự do DPPH của các dung dịch cao chiết được đánh giá qua sự giảm độ hấp thu quang phổ của dung dịch DPPH sau khi phản ứng với dung dịch mẫu thử ở bước sóng 519 nm với các nồng độ mẫu thử khác nhau. Chất kháng oxy hóa trong mẫu thử sẽ phản ứng với gốc tự do DPPH, lượng gốc tự do cịn lại sẽ được phát hiện ở bước sóng 519 nm. Từ sự giảm độ hấp thu quang phổ, tính được hiệu suất làm sạch gốc tự do và dựng đồ thị tuyến tính biểu thị hiệu suất làm
sạch gốc tự do theo nồng độ mẫu thử, từ đó tính được giá trị IC50 dựa vào phương trình tuyến tính.
3.8.2 Chuẩn bị hóa chất
Pha dung dịch DPPH nồng độ 0,1 mM: cân chính xác 1,97 mg DPPH cho vào bình định mức 50 mL sau đó thêm MeOH đến vạch rồi lắc đều đến khi tan hồn tồn, sau đó dung dịch được bảo quản ở nhiệt độ 4℃ trong tối.
Pha dung dịch Vitamin C nồng độ 40 μg/mL: cân chính xác 2 mg Vitamin C cho vào bình định mức 20 mL, sau đó thêm MeOH đến vạch rồi lắc đều đến khi tan hồn tồn. Hút chính xác 2 mL dung dịch vừa pha cho vào ống ly tâm, thêm 8 mL MeOH lắc đều, được 10 mL dung dịch Vitamin C nồng độ 20 μg/mL dùng cho thí nghiệm.
Pha các dung dịch cao chiết hoa Sài đất ba thùy nồng độ 1000 μg/mL: cân chính xác 2 mg cao chiết cho vào effendorf, thêm 2 mL dung môi rồi lắc đều cho tan hoàn toàn thu được dung dịch cao chiết nồng độ 1000 μg/mL. Hút 1 mL dung dịch vừa pha được cho vào ống ly tâm thêm 9 mL dung môi, được dung dịch cao chiết nồng độ 100 μg/mL dùng cho các thí nghiệm.
3.8.3 Khảo sát khả năng quét gốc tự do của cao chiết
Khảo sát khả năng quét gốc tự do DPPH của Vitamin C và của cao chiết bằng cách dựng đường chuẩn giữa khả năng quét gốc tự do và dãy nồng độ chuẩn, sau đó tính nồng độ tại đó 50% gốc tự do được làm sạch (IC50). Đường chuẩn kháng oxy hóa của Vitamin C gồm dãy nồng độ: 0; 1,5; 3; 4,5; 6; 7,5; 9 µg/mL. Đường chuẩn kháng oxy hóa của các cao chiết có cùng dãy nồng độ là: 0, 3, 6, 9, 12, 15 µg/mL.
Quy trình chung: hút V1 µL dung dịch Vitamin C hoặc dung dịch cao chiết thêm vào V2 µL dung dịch gốc tự do DPPH nồng độ 0,1 mM và ủ trong tối ở nhiệt độ phòng trong 30 phút (Bảng 3.1 và Bảng 3.2 tương ứng cho quy trình thử nghiệm trên các cao chiết hoa Sài đất ba thùy và Vitamin C). Đo độ hấp thu quang phổ ở bước sóng 519 nm. Mẫu trắng khơng chứa Vitamin C hoặc cao chiết. Tồn bộ q trình thí nghiệm được thực hiện trong mơi trường tránh sáng. Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần và lấy giá trị trung bình.
Bảng 3.1 Quy trình khảo sát khả năng làm sạch gốc tự do DPPH của các cao MeOH, EtOH 60% và EtOH 96% từ hoa Sài đất ba thùy
Nồng độ cao chiết cuối cùng μg/mL V1 µL (Cao chiết 100 μg/mL) V2 µL (MeOH) V3 µL (DPPH 0,1 mM) 0 0 1500 500 µL cho vào sau cùng
2,25 45 1455
4,5 90 1410
6,75 135 1365
11,25 225 1275
13,5 270 1230
Bảng 3.2 Quy trình khảo sát khả năng làm sạch gốc tự do DPPH của chất đối chứng