CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2.2.3 Đánh giá hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase
Đánh giá tác dụng ức chế enzyme tyrosinase của một số hợp chất từ rong biển đã sàng lọc được. Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzyme tyrosinase theo Chang và cộng sự (2007) [36]. Các bước tiến hành như sau:
Chuẩn bị mẫu thử: Dịch chiết được hòa tan trong dung dịch Dimethyl sulfoxide (DMSO) để được dung dịch gốc có nồng độ là 10mM. Dung dịch gốc tiếp tục được pha loãng bằng nước cất thành các dung dịch có nồng độ 2000 μg/mL; 2500 μg/mL, 3000 μg/mL, 3500 μg/mL và 4000 μg/mL để thực hiện các phản ứng ức chế enzyme.
Đánh giá tác dụng ức chế enzym tyrosinase trong ống nghiệm, tiến hành đo độ hấp thụ ở 475nm trên hệ thống máy đo UV. Chất chứng dương ở đây sử dụng đệm phosphat.
Hỗn hợp phản ứng gồm: 2,2 ml dung dịch đệm Phosphat; 0,1 ml dung dịch cơ chất L-3,4-dihydroxyphenylalanine 2mM; 0,1 ml dung dịch mẫu thử ở các nồng độ khác nhau. Sau khi ủ ống nghiệm trong bể ủ nhiệt trong vòng 3-5 phút ở nhiệt độ 37⁰C bổ sung 100μl dung dịch enzym tyrosinase 100U/ml và lắc 30 giây. Cuối cùng ủ ống nghiệm trong vòng 30 phút ở nhiệt độ 37⁰C và tiến hành ngay việc đo mật độ quang ở bước sóng 475nm.
Mẫu đối chứng có các thành phần tương tự như mẫu thử nhưng dung dịch mẫu thử được thay bằng nước cất 2 lần. Song song với mẫu chứng và mẫu thử ta làm mẫu trắng nhưng 100μl dung dịch enzym tyrosinase 100U/ml, cơ chất L- 3,4- dihydroxyphenylalanine 2mM được thay bằng 100μl dung dịch đệm natri phosphat.
Phần trăm ức chế enzym tyrosinase được tính theo công thức sau:
Trong đó (C: mật độ quang trung bình của mẫu chứng; M: mật độ quang trung bình của mẫu thử; B: mật độ quang trung bình của mẫu trắng )