Cơ chế tổng hợp hạt nano Fe3O4 nhƣ sau: với tỉ phần mol Fe3+/Fe2+ = 2: 1 trong
môi trƣờng kiềm có pH = 9 – 14.
Fe3+ + H2O → Fe(OH)x3–x (thông qua quá trình mất proton) (2.1)
Fe2+ + H2O → Fe(OH)y2–y (thông qua quá trình mất proton) (2.2)
Fe(OH)x3–x + Fe(OH)y2–y → Fe3O4 (thông qua quá trình oxi hóa và dehydride hóa)
(2.3)
Tổng hợp các phản ứng trên chúng ta có phƣơng trình sau:
Fe2+ + 2Fe3+ + 8OH– Fe3O4 + 4H2O (2.4)
Magnetite dễ bị oxi hóa trong không khí thành maghemite (-Fe2O3) theo phƣơng
trình:
4 Fe3O4 + O2 → 6-Fe2O3 (2.5)
Ở nhiệt độ cao, maghemite bị oxi hóa thành hematite (α- Fe2O3).
Mặc dù đồng kết tủa là phƣơng pháp đơn giản nhƣng khi các hạt hình thành chúng kết tụ rất mạnh. Sự kết tụ làm hạn chế khả năng ứng dụng tiếp theo, do đó, đòi hỏi phải có sự biến đổi bề mặt. Ngoài ra, để ứng dụng trong y sinh học các hạt này cần đƣợc chức năng hóa bề mặt với các chất tƣơng thích sinh học.
1.12. Phƣơng pháp tạo lớp bao phủ SiO2 lên hạt nano từ Fe3O4
Có nhiều phƣơng pháp để tạo lớp phủ SiO2 lên hạt nano oxit sắt từ, trong bài này
pháp này đƣợc sử dụng rộng rãi để điều chế các hạt cầu nano silica đơn phân tán qua quá trình thủy phân và ngƣng tụ tetraethylorthosilicate (TEOS) trong dung dịch bazơ gồm nƣớc và rƣợu. Để thúc đẩy hình thành cấu trúc đặc sít hơn là mạng polymer thì trong quá trình điều chế hạt tỉ lệ thể tích của nƣớc/TEOS thƣờng là lớn hơn 20/1 và độ pH cao [12].
Thủy phân (hydrolysis).
(2.6)
(alkolxides Silicon) (silanols)
Ngƣng tụ (polycondensation).
(2.7)
Hình 1.12. Sơ đồ quá trình thủy phân và ngưng tụ TEOS
1.13. Phƣơng pháp chức năng hóa bề mặt hạt nano Fe3O4@SiO2 VỚI APTES
Phản ứng silane hóa bề mặt hạt nano lõi – vỏ Fe3O4@SiO2 bằng APTES diễn ra
theo hai giai đoạn [20]:
– Giai đoạn 1: xảy ra phản ứng thủy phân. Khi đó, nhóm alkoxit (–OC2H5) đƣợc
thay thế bằng nhóm hydroxyl (–OH) để hình thành nhóm hoạt động silanol (Si–OH) trên phân tử APTES.
– Giai đoạn 2: nhóm silanol trên bề mặt hạt nano sẽ liên kết cộng hóa trị với nhóm silanol của APTES để hình thành liên kết Si–O–Si qua phản ứng khử nƣớc.
1.14. Phƣơng pháp tách miễn dịch từ (IMS)
Mặc dù các phƣơng pháp nhanh thƣờng đƣợc sử dụng nhƣng hầu hết các phƣơng pháp này chỉ tập trung và các khía cạnh phát hiện mà bỏ qua giai đoạn xử lý mẫu trƣớc khi phân tích. Thông thƣờng việc phát hiện phát hiện vi sinh vật gây bệnh trên các nền mẫu phức tạp rất khó khăn nếu không có giai đoạn cô đặc và tinh chế. Yêu cầu quan trọng nhất trong xử lý mẫu là ligal phải có ái lực đặc hiệu cao để bắt giữ chọn lọc và cô đặc đƣợc vi sinh vật mục tiêu [41].
Trong nhiều năm, tƣơng tác kháng nguyên – kháng thể đã đƣợc sử dụng để thiết kế kỹ thuật phân tích miễn dịch từ và cảm biến sinh học. Hiệu quả của phức hợp hạt từ mang kháng thể phụ thuộc vào khả năng kháng thể tƣơng thích với bề mặt chất rắn từ tính. Cải tiến đáng kể trong sản xuất các hạt từ đã thu hút mối quan tâm về việc sử dụng chúng làm giá đỡ cho các kháng thể, từ đó tiến hành tóm bắt, phân tách sinh học.
Hình 1.14. Phương pháp tách miễn dịch từ (IMS)
1.15. Phƣơng pháp cố định kháng thể vào giá rắn
Có nhiều yếu tố cần xem xét khi lựa chọn phƣơng pháp cố định kháng thể: giá rắn đƣợc lựa chọn, nhóm chức trên phân tử kháng thể, nhóm phản ứng trên giá rắn, điều kiện cố định, ... Nếu quá trình cố định không phù hợp sẽ gây nên một số tác động: gắn đa điểm, định hƣớng không phù hợp hay che lấp không gian [15],[35]. Cố định kháng thể ngẫu nhiên, trực tiếp thông qua nhóm amin trên phân tử lysine:
Nhóm amin có trên phân tử lysine gặp rất nhiều tại các vị trí dọc theo phân tử kháng thể và cả vùng gắn kháng nguyên. Do đó, quá trình cố định ngẫu nhiên đa hƣớng này có thể làm giảm hoạt tính gắn kháng nguyên của kháng thể. Vì vậy, dung tích gắn sau cùng có thể thấp hơn dự kiến.
Hình 1.15. Các tình huống có thể xảy ra khi kháng thể được gắn ngẫu nhiên vào pha rắn [3].
a. Còn nguyên hoạt tính b. Còn 1 phần hoạt tính c. Không còn hoạt tính
1.16. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng protein theo Bradford
Trong các phƣơng pháp xác định hàm lƣợng protein thì đây là phƣơng pháp có độ nhạy cao, có thể xác định tới 1µg, hoá chất đơn giản ít tốn thời gian. Một ƣu điểm lớn của phƣơng pháp này là ít bị cản trở bởi các hoá chất sử dụng trong nghiên cứu protein.
Phƣơng pháp này dựa trên sự thay đổi bƣớc sóng hấp thu cực đại của thuốc nhuộm Coomassie Brillant Blue khi tạo phức hợp với protein. Trong dung dịch mang tính axit khi chƣa kết nối với protein thì thuốc nhuộm ở dạng màu đỏ có bƣớc sống thấp thu cực đại là 465 nm và khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm chuyển sang dạng màu xanh dƣơng và hấp thu cực đại ở mức cực đại ở bƣớc sóng 595 nm. Độ hấp thu ở bƣớc sóng 596 nm có liên hệ một cách trực tiếp với nồng độ protein. Để xác định protein trong mẫu, đầu tiên ta xây dựng một đƣờng chuẩn với dung dịch protein chuẩn đã biết đƣợc nồng độ. Sau khi cho dung dịch protein vào thuốc nhuộm màu, màu sẽ xuất hiện sau 2 phút và bền tới 1giờ. Tiến hành đo phổ tử ngoại khả kiến của dung dịch ta đƣợc ODx, độ hấp thụ sẽ tỷ lệ với lƣợng proteintrong mẫu. Thực hiện một đối chứng với HCl (ODO). Lấy giá trị ∆OD = ODx– ODO. Lƣợng protein trong mẫu dung dịch đo đƣợc xác định bằng cách dựa vào đƣờng chuẩn từ giá trị ∆OD ở trục tung, từ đó suy ra giá trị nồng độ protein tƣơng ứng trên trục hoành
1.17. Các phƣơng pháp phân tích
1.17.1. Phân tích cấu trúc bằng phổ nhiễu xạ tia X
Phƣơng pháp nhiễu xạ tia X (X-ray Diffaction, XRD)là một kỹ thuật quan trọng cho sự nghiên cứu cấu trúc, xác định pha, nhận dạng thành phần và đo lƣờng kích
thƣớc trung bình của của nhiều loại vật liệu khác nhau.
Khi tia X chiếu vào một mẫu bột, các lớp tinh thể của mẫu hoạt động giống nhƣ những tấm gƣơng phản xạ chùm tia X. Sự giao thoa sau đó xuất hiện giữa chùm tia phản xạ, giữa các dòng khác nhau của nguyên tử trong tinh thể. Điều này thể hiện trong định luật Bragg:
nλ = 2dsinθ (n = 1, 2, 3, ...) (2.8)
: bƣớc sóng tia X( A0); n: Bậc giao thoa; : Góc hợp bởi tia tới và mặt phẳng
mạng; d: Hằng số mạng (khoảng cách giữa các lớp nguyên tử trong tinh thể)
Sự mở rộng đỉnh của đỉnh thí nghiệm nhiễu xạ có thể cho chúng ta các thông tin về đƣờng kính trung bình của hạt thông qua công thức Scherrer:
0,9 (2 )cos D (2.9) D: kích thƣớc hạt (nm) bƣớc sóng của tia X, = 1.54056 Å (2 ) = FWHM: độ bán rộng của vạch nhiễu xạ.
Sản phẩm sau khi tổng hợp xong đƣợc đo nhiễu xạ tia X bằng máy Siemens Diffraktometer Viện Vật Lý Việt Nam.
1.17.2. Phổ hấp thụ hồng ngoại
FT–IR hoạt động dựa trên sự hấp thụ bức xạ hồng ngoại của vật chất cần nghiên cứu. Phƣơng pháp này ghi nhận các dao động đặc trƣng của các liên kết hóa học giữa các nguyên tử, nó cho phép phân tích với hàm lƣợng chất mẫu rất thấp và có thể phân tích cấu trúc, định tính và cả định lƣợng. Có thể đạt độ nhạy rất cao ngay cả khi mẫu chỉ có bề dày cỡ nano mét....
Sản phẩm sau khi tổng hợp đƣợc tiến hành đo tại Viện Địa Lý.
1.17.3. Từ kế mẫu rung
Từ kế mẫu rung (Vibrating Specimen Magnetometer – VSM) thƣờng đƣợc dùng để đo lƣờng tính chất từ của vật liệu nhƣ một hàm của từ trƣờng, nhiệt độ và thời gian. VSM thì dựa trên sự dao động của mẫu trong từ trƣờng để tạo ra một mômen từ xoay chiều trong hệ có đầu dò thích hợp .
Từ kế mẫu rung hoạt động theo nguyên tắc cảm ứng điện từ, sức điện động sinh ra bởi mẫu sắt từ khi chúng dao động với tần số không đổi, dƣới sự có mặt của từ trƣờng không đổi và đồng nhất.
1.17.4. Kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM)
Kính hiển vi điện tử truyền qua TEM (Transmission Electron Microscope) là một công cụ thiết yếu để phân tích một cách trực quan các vật liệu nano. TEM có khả năng quan sát các cấu trúc và hình dạng của mẫu.
Mẫu phân tích là mẫu lỏng, đƣợc phủ lên trên lƣới đồng, nano kim loại sẽ bám vào bề mặt lƣới và đo bằng kính hiển vi điện tử truyền qua TEM, JEM-1400, Nhật (Phòng Thí nghiệm trọng điểm Quốc Gia Vật liệu Polymer và Composite, ĐH Bách Khoa, Tp. HCM). Sau khi tinh chỉnh máy để đạt đƣợc ảnh TEM của hạt nano kim loại rõ nét nhất, các ảnh TEM sẽ đƣợc chụp và gửi dữ liệu đến máy tính dƣới dạng file ảnh.
1.17.5. Phổ tử ngoại khả kiến
Phƣơng pháp đó phổ UV – Vis là một phƣơng pháp định lƣợng, xác định nồng độ của các chất thông qua độ hấp thụ của dung dịch.
Cho chùm ánh sáng có độ dài sóng xác định có thể thấy đƣợc (Vis) hoặc không thấy đƣợc (UV – IR) đi qua vật thể hấp thu (thƣờng ở dạng dung dịch). Dựa vào lƣợng ánh sáng đã bị hấp thu bởi dung dịch mà suy ra nồng độ của dung dịch đó.
1.17.6. Phân tích nhiê ̣t tro ̣ng lƣợng (TGA)
TGA là phƣơng pháp dƣ̣a trên cơ sở xác đi ̣nh khối lƣợng của mẫu vâ ̣t chấ t bi ̣ mất đi ( hoă ̣c nhâ ̣n vào) trong quá trình chuyển pha nhƣ mô ̣t hàm của nhiê ̣t đô ̣.
Khi vâ ̣t chất bi ̣ nung nóng khối lƣợng chúng sẽ bi ̣ mất đi tƣ̀ các quá trình đơn giản nhƣ bay hơi hoă ̣c tƣ̀ các phản ƣ́ng hóa ho ̣c giải phóng k hí. Mô ̣t số vâ ̣t liê ̣u có thể nhâ ̣n đƣơ ̣c khối lƣợng do chúng phản ƣ́ng với môi trƣờng kiểm tra.
Phép đo TGA nhằm xác định : Khối lƣơ ̣ng bi ̣ mất trong quá trình chuyển pha , khối lƣơ ̣ng bi ̣ mất theo thời gian và theo nhiê ̣t đô ̣ do quá trình khử nƣớc hoặc phân ly.
Đƣờng phổ TGA đặc trƣng cho một hợp chất hoặc một hệ do thứ tự của các phản ứng hóa học xuất hiện tại một khoảng nhiệt độ xác định là một hàm của cấu trúc phân tƣ̉. Sƣ̣ thay đổi của khố i lƣợng là kết quả của quá trình đƣ́t gãy hoă ̣c hình thành vô số các liên kết vật lý và hóa học tại một nhiệt độ gia tăng dẫn đến sự bay hơi của các sản phẩm hoă ̣c ta ̣o thành các sản phẩm nă ̣ng hơn.
Nhiê ̣t đô ̣ sƣ̉ du ̣ng bình thƣờng khoảng 1200oC. Môi trƣờng sƣ̉ du ̣ng là khí trơ hoă ̣c
khí tích cực.
Các quá trình diễn ra trong phƣơng pháp phân tích này thông thƣờng là bay hơi , hủy cấu trúc , phân hủy cacbonat , oxi hóa sulphua , oxi hóa florua , tái hydra t hóa…
Đó là các quá trình ta ̣o nên nhƣ̃ng đƣ́t gãy hoă ̣c hình thành các liên kết vâ ̣t lý hóa ho ̣c xảy ra trong mẫu chất.
Đây là phƣơng pháp phân tích khối lƣợng nên nhƣ̃ng thông tin nhâ ̣n đƣợc rất tốt cho viê ̣c xác đi ̣nh thành phần khối lƣợng các chất có mă ̣t trong mô ̣t mẫu chất nào đó . Bên ca ̣nh đó , ta xác đi ̣nh đƣợc thành phần đô ̣ ẩm , thành phần dung môi , chất phu ̣ gia của một loại vật liệu nào đó.
Trong luận văn này, chúng tôi tiến hành đo đạt mẫu bằng các thiết bị và ở
các địa điểm sau:
Ảnh hiển vi điện tử truyền qua (TEM): Mẫu đem phân tích là mẫu lỏng, đƣợc phủ lên trên lƣới đồng, nano kim loại sẽ bám vào bề mặt lƣới và đo bằng kính hiển vi điện tử truyền qua TEM, JEM-1400 (Joel, Japan) tại PTN Trọng điểm QG Vật liệu Polyme và compozit.
Phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR) đƣợc ghi bởi máy quang phổ TENSOR 27 (Brucker, Germany), đo tại phòng thí nghiệm Vật liệu kĩ thuật cao, F.17, trƣờng Đại học Khoa Học Tự Nhiên Tp. Hồ Chí Minh và Viện Vật Lý Việt Nam.
Đƣờng cong từ hóa đƣợc đo ở nhiệt độ phòng bởi từ kế mẫu rung (VSM) MicroSense (USA) – Viện Vật lý TpHCM.
Giản đồ nhiễu xạ tia X (XRD) đƣợc đo bởi máy D8–ADVANCE (Bruker, Germany), điện áp gia tốc 40 KV, cƣờng độ dòng 30 mA, bức xạ Cu–Kα với bƣớc
sóng λ = 1,5406, góc quét 2θ = 10 – 80o,tốc độ quét 0,03o/s – Viện Khoa học Vật liệu,
Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Phân tích nhiệt trọng lƣợng (TGA) đƣợc thực hiện trên máy TGA Q500 V20.13 Build 39 (TA instruments, USA) với khối lƣợng mẫu từ 10 – 25 mg, nhiệt độ thay đổi
từ nhiệt độ phòng đến 900oC, tốc độ gia nhiệt 10oC/phút trong môi trƣờng khí N2 với
CHƢƠNG 2: PHƢƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM
2.1. Vật liệu
Máy khoáy cơ
Máy sấy chân không
Máy ly tâm lạnh 5804 R
Hệ thống máy đọc ELISA, Thermo
Nam châm vĩnh cửu – DynaMag-2, Invitrogen
Ống nghiệm thủy tinh 20 ml
Eppendorf 1,5 ml
Pipet Pasteur nhựa 3 ml
Micropipette 10, 100, 1000 l
Máy lắc xoáy, IKA
Hệ thống điện di Mini Protean, BioRad
Các phiến nhựa ELISA.
2.2. Hóa chất
STT Tên hóa chất Công thức phân tử Xuất xứ
1 Sắt (II) clorua FeCl2.4H2O Sigma
2 Sắt (III) clorua FeCl3.6H2O Sigma
3 Amoniac NH4.OH Sigma
4 Tetraethylorthosilicate (TEOS) Si(OC2H5)4 Merck
5 Ethanol C2H5OH Merck
6 3 – amino propyl triethoxysilane –
(APTES) C9H23NO3Si Sigma
8 Albumin from bovine serum BSA Sigma
9 Ethylene glycol C
4H 6O
2 Merck
11 Sodium acetate trihydrate CH3COONa.3H2O Merck
13 2-[N-morpholino]ethane sulfonic axit] MES Sigma
14 (Sulfo-) N-hydroxy Succinimide NHS Sigma
15 Sodium dodecyl sulfate SDS Sigma
16 Axit clohydric HCl Merck
17 Kháng thể sốt xuất huyết NS3, NS1 Sigma
18 Kháng thể ung thƣ gan Glypican 3 Sigma
Bảng 2.1. Danh mục hóa chất sử dụng trong thực nghiệm
2.3. Tổng hợp hạt trần nano oxít sắt từ Fe3O4 bằng phƣơng pháp đồng kết tủa
Từ sự kế thừa các kết quả nghiên cứu thực nghiệm của nhóm nghiên cứu trƣớc
đây, chúng tôi tiến hành tổng hợp hạt nano oxit sắt Fe3O4 theo thƣờng quy tối ƣu:
Vật liệu:
Iron trichloride – FeCl3.6H2O
Iron dichloride – FeCl2.4H2O
Amoniac – NH4OH
Ethanol – C2H5OH
Nƣớc cất hai lần – H2O
Hình 2.1. Mẫu γ-Fe3O4 và Fe3O4 sau khi sấy và nghiền mịn
Fe3O4
Thực nghiệm:
– Hạt nano đƣợc tổng hợp bằng phƣơng pháp đồng kết tủa và có sự thay đổi về tỷ
số mol Fe3+:Fe2+ = 1,75:1, theo đó 7,5684 g FeCl3.6H2O và 3,1736 g FeCl2.4H2O đƣợc
hòa tan trong 320ml nƣớc cất bằng khuấy cơ trong 30 phút trong môi trƣờng khí N2,
nhiệt độ của hỗn hợp dung dịch duy trì ở 70oC.
– 50 ml dung dịch NH3.H2O đƣợc thêm nhanh vào hỗn hợp dung dịch trên
(pH ~ 9,5) và khuấy thêm 1 giờ nữa cũng trong môi trƣờng khí N2 và ở nhiệt độ 70oC
để phản ứng xảy ra hoàn toàn.
– Để hỗn hợp dung dịch nguội đến nhiệt độ phòng, các hạt kết tủa đƣợc rửa nhiều lần bằng nƣớc cất và đƣợc tách bằng nam châm.
– Các hạt kết tủa đƣợc sấy khô trong môi trƣờng chân không ở 70oC.
2.4. Quy trình tổng hợp hạt ôxít sắt bọc SiO2
Vật liệu:
– Tetraethyl orthosilicate –TEOS (Merck)
– Amoniac –NH4OH (Merck).
– Ethanol –C2H5OH (Merck).
– Nƣớc cất hai lần –H2O (Tại phòng Vật liệu mới và cấu trúc nano – Viện Vật lý).
Các dụng cụ thí nghiệm: Tƣơng tự nhƣ giai đoạn tạo hạt trần.
Thực hiện:
– Đầu tiên cho 20mg Fe3O4 và 8ml H2O siêu âm 30 phút.
– Cho vào hỗn hợp trên 32ml ethanol + 2ml NH3 tiếp tục siêu âm 15 phút.
– Nhỏ giọt thật chậm TEOS. Siêu âm 4 giờ. SiO2 đƣợc tạo thành trên bề mặt các
hạt nano Fe3O4 thông qua sự thủy phân và ngƣng tụ TEOS.
– Các hạt đƣợc tạo thành thì đƣợc quay ly tâm với tốc độ 4000 rpm khoảng 5 phút,
sau đó các hạt nano từ Fe3O4@SiO2 thu đƣợc bằng tách từ và đƣợc rửa với nƣớc khử
ion và ethanol, riêng rẽ, khoảng 5 lần để lấy đi các chất phản ứng dƣ thừa các hạt từ,
dung dịch từ thì đƣợc pha loãng với nƣớc, alcohol và NH4OH. Rung siêu âm hỗn hợp
trên trong bồn nƣớc để chúng đồng nhất với nhau.
Một số phản ứng thuỷ phân TEOS (bọc lớp vỏ SiO2 cho mẫu hạt trần Fe3O4)