2.9. Xác định hiệu suất cộng hợp
Hiệu suất cộng hợp là tỉ số phần trăm giữa hàm lƣợng kháng thể gắn lên hạt từ và lƣợng kháng thể trƣớc khi cộng hợp (với: lƣợng kháng thể gắn lên hạt từ là lƣợng kháng thể trƣớc cộng hợp trừ đi lƣợng kháng thể có trong nƣớc nổi sau khi cộng hợp đƣợc xác định bằng phƣơng pháp Bradford.
Hiệu suất cộng hợp đƣợc tính nhƣ sau: 1
2
% A 100%
H x
A
Với A1: lƣợng kháng thể gắn lên hạt từ. A2: lƣợng kháng thể trƣớc khi cộng hợp.
2.10. Phƣơng pháp tách miễn dịch từ (IMS)
Vật liệu:
– Phức hợp hạt từ - kháng thể. – Đệm rửa: PBS-0,1% Tween 20. – NaCl 0,9%.
Thực nghiệm:
– Lắc xoáy dung dịch hạt từ - kháng thể cho đến khi cặn phân tán đều và hút 2 µl hỗn dịch này vào từng eppendorf 1,5 ml.
– Thêm 1 ml mẫu môi trƣờng tiền tăng sinh hay dãy vi khuẩn pha loãng vào. Thay pipet cho từng mẫu.
– Đặt các eppendorf này vào máy HulaMixer, lắc đảo các eppendorf để trộn đều mẫu và hạt từ - kháng thể trong 10 phút ở nhiệt độ phòng.
– Đặt các eppendorf vào giá mẫu của DynaMag-2. Để yên 3 phút. Mở nắp ống và hút bỏ nƣớc nổi. Thay pipet cho từng mẫu. Lấy thanh từ khỏi DynaMag-2.
– Thêm 1ml đệm rửa. Đậy nắp, lắc vài lần để trộn đều. – Loại bỏ đệm rửa sử dụng nam châm DynaMag-2.
– Rửa lặp lại nhƣ trên 2 lần.
– Sau cùng huyền phù phức hợp hạt từ - vi-rút trong 100 µl đệm rửa hay NaCl 0,9%. Sau đó lắc xoáy.
– Phức hợp hạt từ - vi-rút đƣợc cấy trực tiếp lên môi trƣờng thạch chọn lọc hay nuôi cấy trong môi trƣờng tăng sinh chọn lọc.
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ ĐỀ NGHỊ
Trong đề tài này chúng tôi sử dụng quy trình tạo nano oxit sắt Fe3O4 của nhóm đã
khảo sát cẩn thận từ các đề tài trƣớc để thỏa mãn điều kiện tạo ra hạt trần tối ƣu có tính siêu thuận từ, phân tán tốt, độ từ tính cao, kích thƣớc tƣơng đối đồng đều. Sau đó, chúng tôi tiến hành kiểm chứng bằng cách chụp FT-IR, XRD, TEM, VSM.
Chúng tôi tiếp tục tiến hành khảo sát với lớp vỏ bọc đảm bảo yêu cầu ứng dụng đƣợc trong việc gắn kết với kháng thể đặc hiệu. Theo quy trình của các đồng nghiệp cùng đề tài trƣớc đã tạo ra mẫu hạt trần với lớp vỏ bọc silica, tuy nhiên lớp vỏ còn khá
dày khi chức năng hóa bề mặt với các nhóm –NH2 và –CHO thì từ tính của hạt quá
thấp, nam châm khó giữ đƣợc hạt (Fe3O4 @SiO2/APTES/Glutaraldehyde) trong quá
trình gắn kết với kháng thể dẫn đến xác suất gắn kết không cao và hao tốn sinh phẩm.
Vì vậy chúng tôi phải khảo sát lại với mẫu hạt Fe3O4@SiO2 làm tăng hiệu suất gắn kết
giữa hạt từ và kháng thể, với yêu cầu lớp vỏ bọc phải mỏng hơn để từ tính cao hơn nhƣng vẫn đảm bảo tính tƣơng thích sinh học ứng dụng trong việc dùng kháng thể ứng dụng chẩn đoán bệnh truyền nhiễm.
Quy ước:
F2: Fe3O4
FS: Fe3O4 @ SiO2
FSA: Fe3O4 @ SiO2/APTES
FSAG: Fe3O4 @ SiO2/APTES/Glutaraldehyde
3.1. Tổng hợp hạt nano oxit sắt Fe3O4 (F2)
3.1.1. Phân tích các liên kết bằng phổ hấp thụ hồng ngoại FT – IR
Mẫu F2 sau khi sấy ở 80oC cho bay hơi hết nƣớc rồi đem ra nghiền thành hạt mịn
và chụp phổ FT-IR.
Đầu tiên đỉnh hấp thụ quan sát đƣợc tại số sóng 1625 cm–1, 3387 cm–1 tƣơng ứng
với liên kết –OH do sự hấp thụ nƣớc trên bề mặt các hạt từ. Đỉnh hấp thụ đặc trƣng
của liên kết Fe – O trong vật liệu khối Fe3O4 là 570 và 375 cm–1. Tuy nhiên trong Hình
3.1, hai đỉnh này dịch nhỏ sang vùng số sóng cao tƣơng ứng là 576,55 cm–1và 445,74
cm–1. Hiệu ứng này chủ yếu là do sự suy giảm kích thƣớc hạt làm phá vỡ các liên kết
của nguyên tử bề mặt, kết quả là có sự tái sắp xếp các điện tử bên ngoài lân cận trên bề mặt hạt nano. Nhiều nghiên cứu cho rằng, hệ số lực liên kết tăng khi giảm kích thƣớc hạt, vì vậy đỉnh hấp thụ trong phổ IR dịch về vùng bƣớc sóng dài hơn. Các đỉnh trên
rất phù hợp với đỉnh đặc trƣng của Fe3O4.