2.3. Tổng hợp hạt trần nano oxít sắt từ Fe3O4 bằng phƣơng pháp đồng kết tủa
Từ sự kế thừa các kết quả nghiên cứu thực nghiệm của nhóm nghiên cứu trƣớc
đây, chúng tôi tiến hành tổng hợp hạt nano oxit sắt Fe3O4 theo thƣờng quy tối ƣu:
Vật liệu:
Iron trichloride – FeCl3.6H2O
Iron dichloride – FeCl2.4H2O
Amoniac – NH4OH
Ethanol – C2H5OH
Nƣớc cất hai lần – H2O
Hình 2.1. Mẫu γ-Fe3O4 và Fe3O4 sau khi sấy và nghiền mịn
Fe3O4
Thực nghiệm:
– Hạt nano đƣợc tổng hợp bằng phƣơng pháp đồng kết tủa và có sự thay đổi về tỷ
số mol Fe3+:Fe2+ = 1,75:1, theo đó 7,5684 g FeCl3.6H2O và 3,1736 g FeCl2.4H2O đƣợc
hòa tan trong 320ml nƣớc cất bằng khuấy cơ trong 30 phút trong môi trƣờng khí N2,
nhiệt độ của hỗn hợp dung dịch duy trì ở 70oC.
– 50 ml dung dịch NH3.H2O đƣợc thêm nhanh vào hỗn hợp dung dịch trên
(pH ~ 9,5) và khuấy thêm 1 giờ nữa cũng trong môi trƣờng khí N2 và ở nhiệt độ 70oC
để phản ứng xảy ra hoàn toàn.
– Để hỗn hợp dung dịch nguội đến nhiệt độ phòng, các hạt kết tủa đƣợc rửa nhiều lần bằng nƣớc cất và đƣợc tách bằng nam châm.
– Các hạt kết tủa đƣợc sấy khô trong môi trƣờng chân không ở 70oC.
2.4. Quy trình tổng hợp hạt ôxít sắt bọc SiO2
Vật liệu:
– Tetraethyl orthosilicate –TEOS (Merck)
– Amoniac –NH4OH (Merck).
– Ethanol –C2H5OH (Merck).
– Nƣớc cất hai lần –H2O (Tại phòng Vật liệu mới và cấu trúc nano – Viện Vật lý).
Các dụng cụ thí nghiệm: Tƣơng tự nhƣ giai đoạn tạo hạt trần.
Thực hiện:
– Đầu tiên cho 20mg Fe3O4 và 8ml H2O siêu âm 30 phút.
– Cho vào hỗn hợp trên 32ml ethanol + 2ml NH3 tiếp tục siêu âm 15 phút.
– Nhỏ giọt thật chậm TEOS. Siêu âm 4 giờ. SiO2 đƣợc tạo thành trên bề mặt các
hạt nano Fe3O4 thông qua sự thủy phân và ngƣng tụ TEOS.
– Các hạt đƣợc tạo thành thì đƣợc quay ly tâm với tốc độ 4000 rpm khoảng 5 phút,
sau đó các hạt nano từ Fe3O4@SiO2 thu đƣợc bằng tách từ và đƣợc rửa với nƣớc khử
ion và ethanol, riêng rẽ, khoảng 5 lần để lấy đi các chất phản ứng dƣ thừa các hạt từ,
dung dịch từ thì đƣợc pha loãng với nƣớc, alcohol và NH4OH. Rung siêu âm hỗn hợp
trên trong bồn nƣớc để chúng đồng nhất với nhau.
Một số phản ứng thuỷ phân TEOS (bọc lớp vỏ SiO2 cho mẫu hạt trần Fe3O4)
NH3 + H2O NH4OH
Si(OC2H5)4+C2H5OH+H2O [Si(OH)4]n .xC2H5OH.H2O
[Si(OH)4]n.xC2H5OH.H2O SiO2 + C2H5OH + H2O
2.5. Chức năng hóa bề mặt hạt nano Fe3O4@SiO2 với aptes và glutaraldehyde
Vật liệu: – Hạt trần Fe3O4@SiO2 – APTES – Glutaraldehyde – Ethanol – C2H5OH – Nƣớc cất hai lần – H2O Thực nghiệm:
– Nhỏ chậm 0,4 ml APTES (Siêu âm 2 giờ).
– Lắng hạt bằng nam châm và rửa bằng ethanol và nƣớc. Sấy khô ở nhiệt độ 70oC.
– Lắng hạt bằng nam châm và rửa bằng ethanol và nƣớc. Sấy khô ở nhiệt độ 70oC.
– 20mg hạt nano Fe3O4@SiO2 APTES + 5ml glutaraldehyde. Lắc 12 giờ.
– Lắng hạt bằng nam châm và rửa bằng ethanol và nƣớc. Sấy khô ở nhiệt độ 70oC.
2.6. Kiểm tra độ tinh thể của kháng thể bằng phƣơng pháp điện di trên gel polyacrylamide 12%–SDS polyacrylamide 12%–SDS
Vật liệu:
– Acrylamide – Bis-crylamide – Tris base
– Glycerol – Ammonium persulfate – TEMED – Bromophenol – Methanol – Bromophenol blu – Coomassie R250 – b-mercaptoethanol – Acetic axit
– Thang protein chuẩn: Board Range (161–0317, BioRad) – Kháng thể NS1-dengue 3.
Thực nghiệm:
– Đỗ gel phân tích có nồng độ acryamid 12%-SDS. Chờ cho gel polymer hóa. Đặt lƣợc vào gel để tạo các giếng. Đổ gel tụ chụm có nồng độ acryamid 4%–SDS. Khi gel đông lấy lƣợc ra và lắp gel vào bình điện di.
– Cho dung dịch đệm vào điện di.
– Cho mẫu IgG xử lý với xanh glycerol-SDS vào trong các giếng. – Đậy nắp điện di, lắp nguồn điện. Chạy điện di ở 110 V, 90 mA. – Khi vạch xanh đến đáy thùng. Tắt nguồn.
– Nhuộm với dung dịch Comassive trong 10 phút. Tẩy gel bằng dung dịch tẩy.
2.7. Xác định nồng độ kháng thể bằng phƣơng pháp Bradford
Vật liệu:
– Serva Blue G – Ethanol
– H3PO4 85% (đệm PBS)
– Các phiến nhựa ELISA
– Dung dịch IgG chuẩn (500–0005, BioRad)
Thực hiện:
– Dung dịch IgG chuẩn: pha trong đệm PBS (dải nồng độ đi từ 0 – 32 g/ml).
– Dung dịch IgG chuẩn và dung dịch IgG mẫu đƣợc ủ với dung dịch Bradford trong 5 phút ở nhiệt độ phòng.
– Hấp thụ quang của các dung dịch đƣợc đo ở bƣớc sóng 595 nm. – Dựng đƣờng chuẩn dựa trên IgG chuẩn và độ hấp thu của nó.
– Dựa trên đƣờng chuẩn xác định nồng độ của dung dịch IgG chƣa biết. – Dùng phần mềm KC4 để xác định hàm lƣợng có trong mẫu.
2.8. Cộng hợp kháng thể lên hạt từ
Vật liệu:
– Hạt từ. – Kháng thể.
– MES, PBS, Tween 20, BSA.
Thực hiện:
– Huyền phù hạt từ bằng phƣơng pháp lắc xoáy, thời gian: 30 phút. – Thêm kháng thể, ủ qua đêm ở nhiệt độ phòng
– Rửa hạt từ bằng đệm PBS-1% Tween 20 (3 lần), bảo quản 4C.
– Huyền phù lại hạt từ trong đệm PBS-1% Tween 20-0,1%BSA. Bảo quản phức
hạt từ kháng thể ở 4C.
Trong phƣơng pháp miễn dịch từ, kháng thể đƣợc cố định trên bề mặt từ đóng vai trò quan trọng quyết định khả năng bắt giữ tế bào vi sinh vật mục tiêu. Do đó, để kháng thể sau khi gắn và bề mặt hạt từ đƣợc ổn định trong suốt thời gian ứng dụng không bị thay thế bằng phân tử sinh học khác cần thực hiện thông qua liên kết đồng trị. [22]
Trong đề tài, tôi chọn nhóm amin (–NH2), để thực hiện phản ứng cộng hợp vào
hạt từ bởi vì:
– -amin béo của lysine là nhóm phản ứng phổ biến nhất trên phân tử kháng thể.
Hầu nhƣ tất cả các kháng thể đều chứa rất nhiều lysine, với tần suất cao thứ năm trong 20 axit amin tự nhiên. Một phân tử IgG điển hình có chứa khoảng 90 lysine, trong đó có khoảng 30 phân tử đƣợc biến đổi dƣới các điều kiện nồng độ hóa chất acyl hóa cao và thời gian ủ dài.
– Nhóm –NH2 trên lysine ái nhân khá tốt ở pH trên 8 (pKa = 9,18) do đó phản ứng
Hình 2.2. Cơ chế cộng hợp kháng thể lên hạt từ [57]
2.9. Xác định hiệu suất cộng hợp
Hiệu suất cộng hợp là tỉ số phần trăm giữa hàm lƣợng kháng thể gắn lên hạt từ và lƣợng kháng thể trƣớc khi cộng hợp (với: lƣợng kháng thể gắn lên hạt từ là lƣợng kháng thể trƣớc cộng hợp trừ đi lƣợng kháng thể có trong nƣớc nổi sau khi cộng hợp đƣợc xác định bằng phƣơng pháp Bradford.
Hiệu suất cộng hợp đƣợc tính nhƣ sau: 1
2
% A 100%
H x
A
Với A1: lƣợng kháng thể gắn lên hạt từ. A2: lƣợng kháng thể trƣớc khi cộng hợp.
2.10. Phƣơng pháp tách miễn dịch từ (IMS)
Vật liệu:
– Phức hợp hạt từ - kháng thể. – Đệm rửa: PBS-0,1% Tween 20. – NaCl 0,9%.
Thực nghiệm:
– Lắc xoáy dung dịch hạt từ - kháng thể cho đến khi cặn phân tán đều và hút 2 µl hỗn dịch này vào từng eppendorf 1,5 ml.
– Thêm 1 ml mẫu môi trƣờng tiền tăng sinh hay dãy vi khuẩn pha loãng vào. Thay pipet cho từng mẫu.
– Đặt các eppendorf này vào máy HulaMixer, lắc đảo các eppendorf để trộn đều mẫu và hạt từ - kháng thể trong 10 phút ở nhiệt độ phòng.
– Đặt các eppendorf vào giá mẫu của DynaMag-2. Để yên 3 phút. Mở nắp ống và hút bỏ nƣớc nổi. Thay pipet cho từng mẫu. Lấy thanh từ khỏi DynaMag-2.
– Thêm 1ml đệm rửa. Đậy nắp, lắc vài lần để trộn đều. – Loại bỏ đệm rửa sử dụng nam châm DynaMag-2.
– Rửa lặp lại nhƣ trên 2 lần.
– Sau cùng huyền phù phức hợp hạt từ - vi-rút trong 100 µl đệm rửa hay NaCl 0,9%. Sau đó lắc xoáy.
– Phức hợp hạt từ - vi-rút đƣợc cấy trực tiếp lên môi trƣờng thạch chọn lọc hay nuôi cấy trong môi trƣờng tăng sinh chọn lọc.
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ ĐỀ NGHỊ
Trong đề tài này chúng tôi sử dụng quy trình tạo nano oxit sắt Fe3O4 của nhóm đã
khảo sát cẩn thận từ các đề tài trƣớc để thỏa mãn điều kiện tạo ra hạt trần tối ƣu có tính siêu thuận từ, phân tán tốt, độ từ tính cao, kích thƣớc tƣơng đối đồng đều. Sau đó, chúng tôi tiến hành kiểm chứng bằng cách chụp FT-IR, XRD, TEM, VSM.
Chúng tôi tiếp tục tiến hành khảo sát với lớp vỏ bọc đảm bảo yêu cầu ứng dụng đƣợc trong việc gắn kết với kháng thể đặc hiệu. Theo quy trình của các đồng nghiệp cùng đề tài trƣớc đã tạo ra mẫu hạt trần với lớp vỏ bọc silica, tuy nhiên lớp vỏ còn khá
dày khi chức năng hóa bề mặt với các nhóm –NH2 và –CHO thì từ tính của hạt quá
thấp, nam châm khó giữ đƣợc hạt (Fe3O4 @SiO2/APTES/Glutaraldehyde) trong quá
trình gắn kết với kháng thể dẫn đến xác suất gắn kết không cao và hao tốn sinh phẩm.
Vì vậy chúng tôi phải khảo sát lại với mẫu hạt Fe3O4@SiO2 làm tăng hiệu suất gắn kết
giữa hạt từ và kháng thể, với yêu cầu lớp vỏ bọc phải mỏng hơn để từ tính cao hơn nhƣng vẫn đảm bảo tính tƣơng thích sinh học ứng dụng trong việc dùng kháng thể ứng dụng chẩn đoán bệnh truyền nhiễm.
Quy ước:
F2: Fe3O4
FS: Fe3O4 @ SiO2
FSA: Fe3O4 @ SiO2/APTES
FSAG: Fe3O4 @ SiO2/APTES/Glutaraldehyde
3.1. Tổng hợp hạt nano oxit sắt Fe3O4 (F2)
3.1.1. Phân tích các liên kết bằng phổ hấp thụ hồng ngoại FT – IR
Mẫu F2 sau khi sấy ở 80oC cho bay hơi hết nƣớc rồi đem ra nghiền thành hạt mịn
và chụp phổ FT-IR.
Đầu tiên đỉnh hấp thụ quan sát đƣợc tại số sóng 1625 cm–1, 3387 cm–1 tƣơng ứng
với liên kết –OH do sự hấp thụ nƣớc trên bề mặt các hạt từ. Đỉnh hấp thụ đặc trƣng
của liên kết Fe – O trong vật liệu khối Fe3O4 là 570 và 375 cm–1. Tuy nhiên trong Hình
3.1, hai đỉnh này dịch nhỏ sang vùng số sóng cao tƣơng ứng là 576,55 cm–1và 445,74
cm–1. Hiệu ứng này chủ yếu là do sự suy giảm kích thƣớc hạt làm phá vỡ các liên kết
của nguyên tử bề mặt, kết quả là có sự tái sắp xếp các điện tử bên ngoài lân cận trên bề mặt hạt nano. Nhiều nghiên cứu cho rằng, hệ số lực liên kết tăng khi giảm kích thƣớc hạt, vì vậy đỉnh hấp thụ trong phổ IR dịch về vùng bƣớc sóng dài hơn. Các đỉnh trên
rất phù hợp với đỉnh đặc trƣng của Fe3O4.
Hình 3.1. Phổ hấp thu hồng ngoại FT-IR của mẫu hạt nano oxit sắt Fe3O4 trần.
3.1.2. Phân tích cấu trúc tinh thể bằng phổ nhiễu xạ tia X
Để kiểm chứng lại pha tinh thể và kích thƣớc của mẫu tạo đƣợc, chúng tôi phân
tích phổ XRD của mẫu hạt nano oxit sắt Fe3O4.
Trên hình 3.2 cho thấy hình ảnh XRD của các hạt nano oxit sắt F2. Các đỉnh nhiễu
xạ tại 2θ = 30.12°, 35.52°, 43.62°, 57.02° và 62.62° đặc trƣng cho các pha của các hạt
Fe3O4 đƣợc đánh dấu tƣơng ứng với các họ mặt mạng (220), (311), (400), (511) và
(440). Không có các đỉnh nhiễu xạ khác tƣơng ứng với các muối hoặc oxit sắt khác
nhƣ α–Fe2O3 và γ–Fe2O3. Điều này cho biết các hạt tổng hợp là Fe3O4 có thể coi là
thuần khiết. Tuy nhiên, ta không thể phân biệt rạch ròi giữa hai loại oxit sắt Fe3O4 và
γ–Fe2O3 bởi vì chúng có nhiều tính chất tƣơng đồng, và trong quá trình thí nghiệm có
thể một vài Fe3O4 sẽ biến đổi thành γ–Fe2O3. Do đó ta có lý do để tin rằng mẫu tạo ra
là hỗn hợp của Fe3O4 và một số ít γ–Fe2O3 nhƣng sự nhận dạng chúng thì không quan
trọng trong nghiên cứu này.
Dựa vào giản đồ XRD của các mẫu và áp dụng công thức Scherrer ta có thể tính đƣợc kích thƣớc tinh thể: 0,9 (2 )cos D
Nhận xét: So sánh kết quả chụp TEM với kết quả tính kích thước hạt bằng công thức Scherrer từ giản đồ XRD từ mẫu nano oxit sắt F2 tạo được, chúng tôi thấy kích thước hạt khá nhỏ (< 10nm).
3.1.3. Phân tích hình thái và kích thƣớc hạt bằng ảnh hiển vi điện tử truyền qua (TEM) (TEM)
Chúng tôi tiếp tục tiến hành khảo sát hình dạng và kích thƣớc hạt thông qua kính
hiển vi điện tử truyền qua. Hình 3.3 thể hiện ảnh TEM của mẫu hạt nano oxit sắt F2
theo thứ tự các thang đo 200nm, 50nm và 20nm.
Hình 3.3. Ảnh TEM của mẫu hạt nano oxit sắt F2
ở các thang đo 200nm; 50nm; 20nm.
Nhận xét: Các hạt nano oxit sắt Fe3O4 có dạng gần như hình cầu, các hạt có
kích thước tương đối đồng đềuphân tán tốt.
3.2.1. Phân tích các liên kết bằng phổ FT – IR với mẫu FS
Sử dụng mẫu F2 để tiến hành bọc silica tạo mẫu FS. Sau khi mẫu FS đƣợc sấy
khô, rồi đem nung ở 600oC và đem phân tích FT-IR. Hình 3.4, ta thấy xuất hiện các
đỉnh mới ở vùng số sóng 1080 cm–1 là các số sóng hấp thụ đặc trƣng của các dao động
hóa trị và dao động biến dạng của liên kết Si–O–Si, chứng tỏ rằng có sự tạo thành
mạng SiO2.
Số sóng tại 803 cm–1 đặc trƣng của liên kết SiO4. Ngoài ra, ta thấy đỉnh hấp thụ ở số
sóng 576 cm–1 là đặc trƣng của Fe–O. đã tách ra thành các đỉnh ở số sóng 633,99 cm–1 và
585,09 cm–1, cũng nhƣ đỉnh ở số sóng 445,74 cm–1 đã dịch nhỏ sang vùng số sóng cao, điều
này chứng tỏ có sự tƣơng tác giữa Fe và Si hình thành các liên kết Fe–O–Si.
Nhận xét: Từ những đỉnh hấp thụtrên, ta có thể kết luận rằng SiO2 đã bao phủ thành công trên bề mặt của hạt F2.
3.2.2. Khảo sát lƣợng TEOS nhỏ vào
Ethanol Amoniac Nƣớc Thời gian TEOS Môi trƣờng thí nghiệm FS6 32 ml 2 ml 8 ml 4 giờ 0,6 ml N2 FS4 0,4 ml FS2 0,2 ml
Bảng 3.1. Khảo sát lượng TEOS nhỏ vào của mẫu FS6, FS4, FS2
Hình 3.5. Ảnh TEM của mẫu với lượng TEOS 0,6 ml FS6; 0,4 ml FS4; 0,2 ml FS2 ở
thang đo 200nm (trên) và thang đo 20nm (dưới).
Nhận xét: Giảm lượng TEOS độ phân tán không cao, nhưng độ mỏng của vỏ
giảm đi khá nhiều.
Ethanol Amoniac Nƣớc Thời gian TEOS Môi trƣờng thí nghiệm FS2 32 ml 2 ml 8 ml 4 giờ 0,2 ml N2 FS1 0,1 ml FS05 0,05 ml
Hình 3.6. Ảnh TEM của mẫu với lượng TEOS 0,2ml FS2; 0,1ml FS1; 0,05ml FS05 ở thang đo 200nm (trên) và thang đo 20nm (dưới).
Kết luận: Đối với mẫu FS, quan sát ảnh TEM ta thấy rất rõ cấu trúc lõi-vỏ của hạt Fe3O4@SiO2. Chứng tỏ quá trình phủ SiO2 rất thành công. Hạt có dạng hình
cầu với kích thước hạt trung bình khoảng 20 nm và tương đối đồng đều.
3.2.3. Phổ từ kế mẫu rung – VSM của các mẫu hạt từ F2, FS1, FS2, FS4
Tính chất từ của các mẫu FS tạo thành thể hiện trên hình 3.7. Nhìn vào đƣờng
cong từ hóa, ta thấy ở ba mẫu đều cho thấy lực kháng từ và độ từ dƣ gần tiến tới không, điều này chứng tỏ rằng các mẫu tạo thành đều có tính siêu thuận từ.
Quan sát đƣờng màu xanh dƣơng cho ta kết quả độ từ hóa của mẫu FS1 với lƣợng TEOS 0.1ml là khoảng 46.61 emu/g; đƣờng màu xanh lá ứng với mẫu FS2 với lƣợng TEOS 0.2ml có độ từ hóa là 21.33 emu/g; đƣờng màu hồng với lƣợng TEOS 0.4ml ứng với mẫu FS4 có độ từ hóa là 11.32 emu/g.
Hình 3.7. Phổ từ kế mẫu rung – VSM mẫu F2 khảo sát với mẫu FS4, FS2, FS1
Mẫu TEOS Độ từ hóa cực đại Mmax
(emu/g) Mr/Mmax Nhận xét
FS4 0,4 ml 11,32 0,0045 Độ từ hóa bão hòa
của mẫu FS1 khá cao so với hai mẫu FS2
và FS4
FS2 0,2 ml 21,33 0,0021
FS1 0,1 ml 46,61 0,0060
Bảng 3.3. Độ từ hóa bão hòa của mẫu FS1, FS2 và FS4
3.2.4.So sánh phổ từ kế mẫu rung – VSM của các mẫu hạt từ trƣớc và sau khi chức năng hóa bề mặt