Công thức CT1 CT2 CT3 CT4 CT5
NaCl(g/100ml) 0 16 32 48 64
RH% 100 90 80 70 60
Dung dịch pha xong đổ vào bình hút ẩm, mỗi bình 500ml. Cấy nấm vào chính giữa đĩa thạch PDA, mỗi bình hút ẩm đặt 24 mẫu tƣơng ứng 24 đĩa thạch đã cấy nấm, đậy nắp lại để trong tối ở nhiệt độ phòng, đo kết quả sau 14 ngày. Thí nghiệm lặp lại 5 lần. Đo đƣờng kính trug bình của hệ sợi nấm làm kết quả đánh giá sự phát triển của nấm gây bệnh.
3.4.2.3 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng của hệ sợi nấm
Điều chỉnh pH của môi trƣờng nuôi cấy bằng acid HCl 10% và KOH 10% để tạo môi trƣờng dinh dƣỡng có trị số pH khác nhau 4; 4.5; 5; 5.5; 6; 6.5; 7; 7.5; 8.
Sau khi điều chỉnh pH trong các bình tam giác, môi trƣờng đƣợc hấp khử trùng ở 121oC và 1 atm trong 30 phút. Đổ môi trƣờng có các mức pH khác nhau vào các đĩa Petri đã đƣợc khử trùng dày 2-3mm. Sau khi mặt thạch khô, đông cứng, tiến hành cấy nấm vào chính giữa đĩa thạch, băng kín để vào tủ định ôn 28oC. Mỗi thang pH đặt 1 đĩa thạch với 24 mẫu tƣơng đƣơng 24 đĩa thạch. Thí nghiệm lặp lại 5 lần. Đo kết quả sau 14 ngày. Đo đƣờng kính trung bình của hệ sợi nấm làm kết quả đánh giá sự phát triển của nấm gây bệnh.
3.4.3 Phương pháp tách chiết cặn dịch chiết từ lá của 57 dòng Keo lá tràm với dung môi hữu cơ
3.4.3.1 Chuẩn bị mẫu - Phơi mẫu lá
Lá tƣơi (0,5 – 1kg) sau khi lấy ngoài thực địa đƣợc rửa sạch phơi khô ở nhiệt độ phòng từ 10 – 15 ngày, quá trình phơi phải thƣờng xuyên đảo mẫu để lá đƣợc khô đều.
- Xay mẫu lá
Các mẫu đƣợc nghiền nhỏ bởi máy nghiền mẫu khô. Trƣớc và sau khi nghiền, các bộ phận của máy phải đƣợc lau sạch sẽ, tránh để xảy ra hiện tƣợng bột lá của mẫu trƣớc lẫn với bột của mẫu sau. Mỗi mẫu khi nghiền song đƣợc cho và túi nilon, đánh số kí hiệu (56 dòng) và bảo quản tránh làm mẫu bị ẩm.
3.4.3.2 Phương pháp tách chiết cặn dịch chiết với dung môi Methanol (CH3OH)
a. Đặc điểm của dung môi (CH3OH)
Hoá chất Methanol (CH3OH), viết tắt là ME là một chất lỏng không màu, có mùi hơi ngọt, dễ cháy, nhiệt độ sôi 39,6o
C. Là dung môi hữu cơ thông dụng trong phòng thí nghiệm và ít độc hại cho con ngƣời.
b. Phương pháp tách chiết Bước 1: Chiết dung môi
Cân 15g lƣợng bột lá trong mỗi túi mẫu cho vào các bình tam giác. Sau đó lấy 150ml methanol vào bình và bịt kín bằng farafin rồi ngâm các mẫu trong 48h. Tƣơng ứng với mỗi bình cũng phải đƣợc đánh số kí hiệu.
Bước 2: Cô quay, thu hóa chất
Các bình dùng để cô quay có thể tích lần lƣợt là 250ml, 500ml, 1000ml. Trƣớc khi cô quay bình phải đƣợc sấy khô và cân khối lƣợng, sau khi cô quay lại cân khối lƣợng của bình và trừ đi khối lƣợng của bình ban đầu sẽ thu đƣợc khối lƣợng chất còn lại. Sử dụng dung môi CH3OH với tỷ lệ 1:10 để hòa tan.
Lắc đều bình để các chất đƣợc hòa tan rồi đổ vào ống nghiệm, bịt kín miệng ống nghiệm và dán nhãn.
Khối lƣợng thực của hợp chất đƣợc tính theo công thức
m1,2 = ms1,2 – mt1,2
mt1, mt2: Khối lượng bình trước khi cô quay với dung môi ME và MC
ms1,ms2: Khối lượng bình sau khi cô quay với dung môi ME và MC
m1,m2 : Khối lượng thực của hợp chất
3.4.3.3 Phương pháp tách chiết cặn dịch chiết với dung môi CH2Cl2 a. Đặc điểm của dung môi (CH2Cl2)
Hóa chất methylene chloride (CH2Cl2), viết tắt MC: Là chất lỏng trong suốt, không màu, bay hơi nhanh và có mùi giống mùi của ether. Có khả năng hoà tan tốt nhiều loại nhựa, sáp, chất béo, ethanol, các dung môi có clo khác nhƣng hoà tan trong nƣớc rất ít. Khả năng cháy thấp vì giới hạn cháy rất hẹp và cần năng lƣợng cháy rất cao. Nhiệt độ sôi thấp, áp suất hơi cao nên dễ dàng thu hồi hoàn toàn, độc tính thấp.
b. Phương pháp tách chiết
Phƣơng pháp đƣợc thực hiện tƣơng tự nhƣ với dung môi CH3OH.
3.4.4 Phương pháp đánh giá khả năng ức chế nấm gây bệnh
a. Chuẩn bị môi trường: Môi trường PDA
Khoai tây : 200g Glucozo : 20g Agar : 18g Nƣớc : 1000ml
Khoai tây rửa sạch để cả vỏ cắt thành miếng có kích thƣớc 1cm3 rồi cho vào nồi với 1000ml nƣớc, đun sôi 30 phút tính từ lúc sôi. Dùng khăn sạch lọc
lấy nƣớc trong cho thêm nƣớc vào cho vừa tròn 1lít sau đó cho Glucozo và Agar vào nồi và khuấy đều để hòa tan. Tất cả các môi trƣờng sau khi pha chế và đun nấu song đều đƣợc đổ vào bình tam giác đã đƣợc rửa sạch và sấy khô cho vào hấp khử trùng ở nhiệt độ 1210C (tƣơng đƣơng áp suất 1atm) trong thời gian 30 phút.
b. Đánh giá hiệu lực ức chế nấm gây bệnh trên đĩa thạch theo phương pháp của Singh và Tripathi (1999) đã có điều chỉnh
Đánh giá hiệu lực ức chế nấm gây bệnh của cặn dịch chiết với từng loại dung môi (ME, MC). Cặn dịch chiết đƣợc hòa tan bằng dung môi ME và MC theo tỷ lệ 1g cặn dịch chiết hòa tan trong 10ml dung môi, tƣơng ứng nồng độ 10%. Pha loãng bào tử nấm C. manginecans ở mật độ từ 1,6x104- 1,8x104CFU/ml, đong 30µl dung dịch bào tử nấm gây bệnh đã pha loãng vào mỗi hộp lồng có chứa môi trƣờng PDA (Potato Dextrose Agar), phân tán đều bào tử nấm trên bề mặt môi trƣờng. Đục 3 lỗ/hộp lồng đã đƣợc phân tán đều bào tử C. manginecans, đƣờng kính lỗ đục 5mm và lấy 50µl cặn dịch chiết đã pha loãng của từng dòng Keo lá tràm cho vào các lỗ đã đục, mỗi công thức thí nghiệm (cặn dịch chiết của các dòng keo) thực hiện trên 4 hộp lồng, lặp lại 3 lần và thực hiện riêng cho từng loại dung môi. Thí nghiệm đƣợc thực hiện với cặn dịch chiết từ lá của 57 dòng Keo lá tràm và các công thức đối chứng gồm dung môi (ME, MC), nƣớc cất và kháng sinh tiêu chuẩn Nystatin 1%. Các hộp lồng thí nghiệm đƣợc đặt trong tủ định ôn ở 25oC, sau 7 ngày tiến hành đo đƣờng kính vòng ức chế của cặn dịch chiết đối với nấm gây bệnh.
Phân cấp khả năng ức chế nấm gây bệnh dựa vào đƣờng kính vòng ức chế theo 5 cấp nhƣ sau: