3.2.1 Đối tượng nghiên cứu
- Các mẫu lá của các dòng Keo lá tràm đƣợc thu thập tại khu vực nghiên cứu.
- Nấm gây bệnh chết héo Ceratocystis sp.
3.2.2 Phạm vi nghiên cứu
- 57 dòng Keo lá tràm tại khu khảo nghiệm Sông Mây – Đồng Nai. - Nghiên cứu chung về đặc điểm hình thái của nấm Ceratocystis sp. - Nghiên cứu về tính gây bệnh của các chủng Ceratocystis sp.
- Nghiên cứu ảnh hƣởng của các nhân tố nhiệt độ, độ ẩm, pH tới sự phát triển của các chủng Ceratocystis sp.
- Nghiên cứu về tính kháng thông qua cặn dịch chiết có trong lá Keo lá tràm có khả năng kháng Ceratocystis sp bằng 2 dung môi ME và MC.
3.2.3 Thời gian nghiên cứu
Đề tài đƣợc nghiên cứu trong 2 năm 2015 - 2016
3.3 Nội dung nghiên cứu
- Phân lập và đặc điểm của nấm gây bệnh chết héo Keo lá tràm: + Mô tả triệu chứng bệnh.
+ Xác định nguyên nhân gây bệnh.
+ Đánh giá tính gây bệnh của nấm Ceratocystis sp.
+ Định danh nấm gây bệnh Ceratocystis sp.
- Ảnh hƣởng của một số nhân tố tới sự phát triển của nấm gây bệnh chết héo: + Ảnh hƣởng của nhiệt độ.
+ Ảnh hƣởng của độ ẩm. + Ảnh hƣởng của pH.
- Tách chiết cặn dịch chiết từ lá của các dòng Keo lá tràm với dung môi hữu cơ
+ Tách chiết cặn dịch chiết với dung môi methanol (ME)
+ Tách chiết cặn dịch chiết với dung môi dimethylcloride (MC)
- Đánh giá khả năng ức chế nấm gây bệnh đối với cặn dịch chiết đƣợc tách chiết từ lá với 2 loại dung môi của các gia đình Keo lá tràm.
- Tuyển chọn các dòng Keo lá tràm sinh trƣởng nhanh kháng nấm gây bệnh chết héo.
3.4 Phƣơng pháp nghiên cứu
3.4.1 Phương pháp phân lập và nghiên cứu đặc điểm nấm gây bệnh hại Keo lá tràm
3.4.1.1 Phương pháp phân lập nấm gây bệnh chết héo
* Phân lập nấm Ceratocystis sp. gây bệnh chết héo trên Keo lá tràm Mẫu thân cành bị bệnh sau khi thu ngoài hiện trƣờng đƣợc cƣa thành từng đoạn đánh ký hiệu rồi mang về phòng thí nghiệm.
Sử dụng phƣơng pháp bẫy nấm bằng cà rốt, trƣớc tiên củ cà rốt đƣợc cắt thành từng khoanh có độ dày 0,5 -1cm và xẻ rãnh ở giữa. Lấy cành keo bị bệnh, cắt thành các đoạn, chẻ nhỏ khoảng 2- 3 cm, dày 2mm, sau đó đặt vào
giữa miếng cà rốt, dùng băng cuốn quanh mẫu cà rốt. Đặt các miếng cà rốt vào hộp lồng có giấy ẩm, hộp lồng cần có độ ẩm thích hợp không đƣợc ẩm quá cũng nhƣ khô quá để tạo môi trƣờng thích hợp cho sự phát triển của nấm bệnh. Để hộp lồng trong tủ định ôn 2 - 3 ngày thấy trên bề mặt các mẫu cà rốt trong hộp lồng xuất hiện các vết màu đen, để càng lâu ngày thì các vết đen càng lan rộng, đó là do sự phát triển của nấm bệnh (lƣu ý cành đƣợc làm ẩm phải là cành có vết bệnh, nếu vết bệnh càng mới thì càng tốt).
Tiến hành làm thuần nấm bệnh bằng cách: Đặt các mẫu cà rốt soi trên kính hiển vi soi nổi Olympus SZ - PT để tìm bào tử nấm, Sau đó dùng que cấy đã đƣợc khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn hớt nhẹ bào tử trên bề mặt cà rốt đƣa vào hộp lồng có chứa môi trƣờng PDA và băng kín, ghi tên để hộp lồng vào tủ định ôn và theo dõi sự phát triển của nấm bệnh. Khi sợi nấm bắt đầu mọc, tiếp tục cấy truyền sang các đĩa PDA mới cho đến khi thu đƣợc nấm thuần khiết.
3.4.1.2 Phương phápgiám định nguyên nhân gây bệnh
Giám định và định danh sinh vật gây hại bằng phƣơng pháp sinh học phân tử.
Tách chiết ADN: Tiến hành thu pellet nấm sau khi nấm đã đƣợc làm thuần trên môi trƣờng PDA. Sau đó đem nghiền nhanh trong ni tơ lỏng thành dạng bột mịn. Mẫu đƣợc chuyển vào ống eppendorf 1,5 ml đã bổ sung dịch phá tế bào và 50µl protease K (200mg/ml) trong 3 giờ ở 560C. Tiếp theo, bổ sung 200µl dung dịch 5M potassium acetate vào ống eppendorf chứa mẫu rồi ủ 10 phút trong đá. Sau khi ly tâm 10 phút, dịch nổi chứa ADN tiếp tục đƣợc chiết bằng chloroform: isoamyl alcohol với tỷ lệ 24:1 để loại protein và tủa ADN bằng 100% isopropanol. ADN đƣợc hòa tan trong đệm TE, pH 8 điện di kiểm tra và bảo quản ở - 200C.
Phân đoạn rADN của nấm đƣợc khuếch đại bằng các mồi β – tubulin 1( βT1) và Elongation factor 1 –α (EF1 – α) để đọc trình tự đoạn gên 26S rADN.
Sản phẩm PCR sau khi khuếch đại đƣợc tinh chế bằng Silica bead ADN gel extraction. Sử dụng máy đọc trình tự model 3500 Genetic alalyzer của hãng Thermo, Mỹ. Các chuỗi ADN đƣợc so sánh với cơ sở dữ liệu của GenBank.
3.4.1.3 Phương pháp đánh giá tính gây bệnh
Đánh giá tính gây bệnh theo phƣơng pháp gây bệnh nhân tạo trên cành của O‟Gara và đồng tác giả ( 1996 ).
Ở rừng keo 2 năm tuổi, chọn những cành keo bánh tẻ khoảng 6 tháng tuổi, đƣờng kính trung bình 0,8 – 1,1 cm.
Cắt các cành với độ dài đồng đều 30cm, sau khi cắt, tiến hành nhúng ngay 2 đầu cành vào dung dịch parafin lỏng để chống mất nƣớc và bảo quản ở nhiệt độ 250C – 280C và tiến hành gây bệnh nhân tạo trong phòng thí nghiệm.
Khoét vỏ chính giữa cành dài 0,5cm. Sau đó đục thạch đã có nấm bệnh đặt vào chỗ vừa khoét. Lấy vỏ đậy lại và bên ngoài dùng bông để ẩm đè lên. Tiếp tục dùng parafin băng lại.
Mỗi chủng nấm thí nghiệm với 30 cành, để các cành keo đã nhiễm nấm vào túi nilon. Bảo quản ở nhiệt độ 250C. Sau 10 ngày tiến hành kiểm tra và đo đếm tốc độ phát triển của nấm bệnh.
Tính gây bệnh của nấm Ceratocystis sp. đƣợc phân cấp thành 4 cấp bệnh.
Bảng 3.1 Bảng phân cấp tính gây bệnh Ceratocystis sp. trên cành Cấp bệnh Chiều dài vết bệnh (L) Tính gây bệnh
0 L = 0 cm Không gây bệnh (-)
1 L ≤ 5cm Gây bệnh yếu (+)
2 5cm < L ≤ 10 cm Gây bệnh trung bình (++) 3 10cm < L ≤ 15cm Gây bệnh mạnh (+++) 4 L > 15cm Gây bệnh rất mạnh (++++)
3.4.2 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của 1 số nhân tố tới các chủng Ceratocystis sp.
3.4.2.1 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng của hệ sợi nấm
Cấy nấm Ceratocytis sp. gây bệnh vào chính giữa đĩa Petri có chứa môi trƣờng PDA, xếp các đĩa này vào các tủ định ôn có các thang nhiệt khác nhau 10oC± 1; 15oC± 1; 20oC± 1; 25oC± 1; 30oC± 1; 35oC± 1, mỗi thang nhiệt sử dụng 5 đĩa thạch, đo kết quả sau 14 ngày. Thí nghiệm lặp lại 1 lần. Đo đƣờng kính trung bình của hệ sợi nấm làm kết quả đánh giá sự phát triển của nấm gây bệnh.
3.4.2.2 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của ẩm độ không khí đến sinh trưởng của hệ sợi nấm
Phƣơng pháp đƣợc tiến hành theo Both.C: pha NaCl với các nồng độ khác nhau trong bình hút ẩm để tạo môi trƣờng không khí có độ ẩm không khí (RH%) khác nhau.
Bảng 3.2 Công thức tạo độ ẩm môi trƣờng
Công thức CT1 CT2 CT3 CT4 CT5
NaCl(g/100ml) 0 16 32 48 64
RH% 100 90 80 70 60
Dung dịch pha xong đổ vào bình hút ẩm, mỗi bình 500ml. Cấy nấm vào chính giữa đĩa thạch PDA, mỗi bình hút ẩm đặt 24 mẫu tƣơng ứng 24 đĩa thạch đã cấy nấm, đậy nắp lại để trong tối ở nhiệt độ phòng, đo kết quả sau 14 ngày. Thí nghiệm lặp lại 5 lần. Đo đƣờng kính trug bình của hệ sợi nấm làm kết quả đánh giá sự phát triển của nấm gây bệnh.
3.4.2.3 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng của hệ sợi nấm
Điều chỉnh pH của môi trƣờng nuôi cấy bằng acid HCl 10% và KOH 10% để tạo môi trƣờng dinh dƣỡng có trị số pH khác nhau 4; 4.5; 5; 5.5; 6; 6.5; 7; 7.5; 8.
Sau khi điều chỉnh pH trong các bình tam giác, môi trƣờng đƣợc hấp khử trùng ở 121oC và 1 atm trong 30 phút. Đổ môi trƣờng có các mức pH khác nhau vào các đĩa Petri đã đƣợc khử trùng dày 2-3mm. Sau khi mặt thạch khô, đông cứng, tiến hành cấy nấm vào chính giữa đĩa thạch, băng kín để vào tủ định ôn 28oC. Mỗi thang pH đặt 1 đĩa thạch với 24 mẫu tƣơng đƣơng 24 đĩa thạch. Thí nghiệm lặp lại 5 lần. Đo kết quả sau 14 ngày. Đo đƣờng kính trung bình của hệ sợi nấm làm kết quả đánh giá sự phát triển của nấm gây bệnh.
3.4.3 Phương pháp tách chiết cặn dịch chiết từ lá của 57 dòng Keo lá tràm với dung môi hữu cơ
3.4.3.1 Chuẩn bị mẫu - Phơi mẫu lá
Lá tƣơi (0,5 – 1kg) sau khi lấy ngoài thực địa đƣợc rửa sạch phơi khô ở nhiệt độ phòng từ 10 – 15 ngày, quá trình phơi phải thƣờng xuyên đảo mẫu để lá đƣợc khô đều.
- Xay mẫu lá
Các mẫu đƣợc nghiền nhỏ bởi máy nghiền mẫu khô. Trƣớc và sau khi nghiền, các bộ phận của máy phải đƣợc lau sạch sẽ, tránh để xảy ra hiện tƣợng bột lá của mẫu trƣớc lẫn với bột của mẫu sau. Mỗi mẫu khi nghiền song đƣợc cho và túi nilon, đánh số kí hiệu (56 dòng) và bảo quản tránh làm mẫu bị ẩm.
3.4.3.2 Phương pháp tách chiết cặn dịch chiết với dung môi Methanol (CH3OH)
a. Đặc điểm của dung môi (CH3OH)
Hoá chất Methanol (CH3OH), viết tắt là ME là một chất lỏng không màu, có mùi hơi ngọt, dễ cháy, nhiệt độ sôi 39,6o
C. Là dung môi hữu cơ thông dụng trong phòng thí nghiệm và ít độc hại cho con ngƣời.
b. Phương pháp tách chiết Bước 1: Chiết dung môi
Cân 15g lƣợng bột lá trong mỗi túi mẫu cho vào các bình tam giác. Sau đó lấy 150ml methanol vào bình và bịt kín bằng farafin rồi ngâm các mẫu trong 48h. Tƣơng ứng với mỗi bình cũng phải đƣợc đánh số kí hiệu.
Bước 2: Cô quay, thu hóa chất
Các bình dùng để cô quay có thể tích lần lƣợt là 250ml, 500ml, 1000ml. Trƣớc khi cô quay bình phải đƣợc sấy khô và cân khối lƣợng, sau khi cô quay lại cân khối lƣợng của bình và trừ đi khối lƣợng của bình ban đầu sẽ thu đƣợc khối lƣợng chất còn lại. Sử dụng dung môi CH3OH với tỷ lệ 1:10 để hòa tan.
Lắc đều bình để các chất đƣợc hòa tan rồi đổ vào ống nghiệm, bịt kín miệng ống nghiệm và dán nhãn.
Khối lƣợng thực của hợp chất đƣợc tính theo công thức
m1,2 = ms1,2 – mt1,2
mt1, mt2: Khối lượng bình trước khi cô quay với dung môi ME và MC
ms1,ms2: Khối lượng bình sau khi cô quay với dung môi ME và MC
m1,m2 : Khối lượng thực của hợp chất
3.4.3.3 Phương pháp tách chiết cặn dịch chiết với dung môi CH2Cl2 a. Đặc điểm của dung môi (CH2Cl2)
Hóa chất methylene chloride (CH2Cl2), viết tắt MC: Là chất lỏng trong suốt, không màu, bay hơi nhanh và có mùi giống mùi của ether. Có khả năng hoà tan tốt nhiều loại nhựa, sáp, chất béo, ethanol, các dung môi có clo khác nhƣng hoà tan trong nƣớc rất ít. Khả năng cháy thấp vì giới hạn cháy rất hẹp và cần năng lƣợng cháy rất cao. Nhiệt độ sôi thấp, áp suất hơi cao nên dễ dàng thu hồi hoàn toàn, độc tính thấp.
b. Phương pháp tách chiết
Phƣơng pháp đƣợc thực hiện tƣơng tự nhƣ với dung môi CH3OH.
3.4.4 Phương pháp đánh giá khả năng ức chế nấm gây bệnh
a. Chuẩn bị môi trường: Môi trường PDA
Khoai tây : 200g Glucozo : 20g Agar : 18g Nƣớc : 1000ml
Khoai tây rửa sạch để cả vỏ cắt thành miếng có kích thƣớc 1cm3 rồi cho vào nồi với 1000ml nƣớc, đun sôi 30 phút tính từ lúc sôi. Dùng khăn sạch lọc
lấy nƣớc trong cho thêm nƣớc vào cho vừa tròn 1lít sau đó cho Glucozo và Agar vào nồi và khuấy đều để hòa tan. Tất cả các môi trƣờng sau khi pha chế và đun nấu song đều đƣợc đổ vào bình tam giác đã đƣợc rửa sạch và sấy khô cho vào hấp khử trùng ở nhiệt độ 1210C (tƣơng đƣơng áp suất 1atm) trong thời gian 30 phút.
b. Đánh giá hiệu lực ức chế nấm gây bệnh trên đĩa thạch theo phương pháp của Singh và Tripathi (1999) đã có điều chỉnh
Đánh giá hiệu lực ức chế nấm gây bệnh của cặn dịch chiết với từng loại dung môi (ME, MC). Cặn dịch chiết đƣợc hòa tan bằng dung môi ME và MC theo tỷ lệ 1g cặn dịch chiết hòa tan trong 10ml dung môi, tƣơng ứng nồng độ 10%. Pha loãng bào tử nấm C. manginecans ở mật độ từ 1,6x104- 1,8x104CFU/ml, đong 30µl dung dịch bào tử nấm gây bệnh đã pha loãng vào mỗi hộp lồng có chứa môi trƣờng PDA (Potato Dextrose Agar), phân tán đều bào tử nấm trên bề mặt môi trƣờng. Đục 3 lỗ/hộp lồng đã đƣợc phân tán đều bào tử C. manginecans, đƣờng kính lỗ đục 5mm và lấy 50µl cặn dịch chiết đã pha loãng của từng dòng Keo lá tràm cho vào các lỗ đã đục, mỗi công thức thí nghiệm (cặn dịch chiết của các dòng keo) thực hiện trên 4 hộp lồng, lặp lại 3 lần và thực hiện riêng cho từng loại dung môi. Thí nghiệm đƣợc thực hiện với cặn dịch chiết từ lá của 57 dòng Keo lá tràm và các công thức đối chứng gồm dung môi (ME, MC), nƣớc cất và kháng sinh tiêu chuẩn Nystatin 1%. Các hộp lồng thí nghiệm đƣợc đặt trong tủ định ôn ở 25oC, sau 7 ngày tiến hành đo đƣờng kính vòng ức chế của cặn dịch chiết đối với nấm gây bệnh.
Phân cấp khả năng ức chế nấm gây bệnh dựa vào đƣờng kính vòng ức chế theo 5 cấp nhƣ sau:
Bảng 3.3 Bảng phân cấp khả năng ức chế nấm gây bệnh Cấp kháng Đƣờng kính vòng ức chế (D) Khả năng ức chế nấm gây bệnh 0 D = 0mm Không có khả năng ức chế (-) 1 D ≤ 5mm Khả năng ức chế yếu (+) 2 5mm < D ≤ 10mm Khả năng ức chế trung bình (++) 3 10mm < D ≤ 15mm Khả năng ức chế mạnh (+++) 4 D > 15mm Khả năng ức chế rất mạnh (++++)
3.4.5 Phương pháp tuyển chọn các dòng Keo lá tràm
3.4.5.1 Phương pháp thu thập số liệu đánh giá tình hình sinh trưởng của các dòng Keo lá tràm
Phƣơng pháp kế thừa số liệu của đề tài: “Nghiên cứu chọn các dòng Keo và Bạch đàn chống chịu bệnh có năng xuất cao phục vụ trồng rừng kinh tế ” của PGS.TS Nguyễn Hoàng Nghĩa. Kết quả sinh trƣởng và chỉ số bệnh của các dòng Keo lá tràm tại Đồng Nai trồng tháng 08/2014, số liệu đo 8/2015.
3.4.5.2 Phương pháp đánh giá tình hình gây bệnh chết héo tại rừng trồng Keo lá tràm
Thu thập thông tin từ các cơ quan chính quyền địa phƣơng, cán bộ lâm trƣờng và ngƣời dân về tình hình dịch bệnh chết héo tại các địa điểm nghiên cứu.
Chọn địa điểm điều tra: trên các rừng trồng Keo lá tràm tiến hành điều tra theo Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8928 : 2013.
Lập 6 ô tiêu chuẩn điển hình, mỗi ô diện tích 1000 m2 tại các lâm phần đã chọn. Điều tra 30 cây/1OTC theo nguyên tắc hệ thống về tỷ lệ cây bị bệnh và mức độ bị bệnh.
Phân cấp mức độ bị bệnh với 5 cấp bệnh theo phƣơng pháp của Phạm Quang Thu và đồng tác giả.
Bảng 3.4 Bảng phân cấp mức độ bị bệnh trên Keo lá tràm
Cấp bệnh Biểu hiện bên ngoài
0 Cây khoẻ, không có bết bệnh trên thân, cành 1 Chiều dài vết bệnh < 10 cm
2 10 cm ≤ Chiều dài vết bệnh < 20 cm, lá cây bắt đầu chuyển màu vàng 3 20 cm ≤ Chiều dài bết bện < 30 cm, lá cây đã chuyển màu vàng
4 Chiều dài vết bệnh ≥ 30cm, lá bị héo, khô, rụng, cây chết
3.4.5.3 Phương pháp tuyển chọn các dòng Keo lá tràm sinh trưởng nhanh kháng bệnh
Căn cứ vào chỉ tiêu V (dcm3/cây) để tuyển chọn những dòng có tốc độ sinh trƣởng nhanh, dòng đƣợc chọn là dòng có chỉ tiêu V (dm3/cây) đạt trên mức trung bình của 57 dòng Keo lá tràm. Đồng thời kết hợp với trị số
D ≥10mm để tuyển chọn các dòng vừa có mức sinh trƣởng nhanh vừa có khả năng kháng nấm.
CHƢƠNG IV. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 4.1 Phân lập và mô tả đặc điểm của nấm gây bệnh chết héo Keo lá tràm