CHƢƠNG 1 : TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU
1.2.4. Quy trình nhân giống invitro
Quy trình nhân giống đƣợc chia làm 5 giai đoạn:
a. Lấy mẫu và xử lý mẫu
Đây là giai đoạn đầu tiên trong quy trình, cần đặc biệt chú ý vì những đặc tính của mẫu cấy sẽ đƣợc duy trì và nhân lên ở tất cả các cây giống sau này. Do vậy cần chọn lọc cây mẹ ƣu việt, sinh trƣởng phát triển tốt, năng suất cao, có giá trị kinh tế cao; Trên cây mẹ tiến hành chọn cơ quan, mô để lấy mẫu, thƣờng là chồi non, đoạn thân có chồi ngủ, hoa non, lá non, rễ củ… Khả năng nhiễm bệnh của mẫu phụ thuộc vào cách lấy mẫu, xử lý mẫu và điều kiện khử trùng. Mỗi loài cây có ngƣỡng nhiệt độ và độ ẩm phù hợp khi bảo quản và xử lý mẫu.
b. Tái sinh mẫu nuôi cấy
Mục đích của giai đoạn này là tái sinh các cơ quan từ mẫu nuôi cấy. Khả năng thành công của nuôi cấy mô tế bào thực vật phụ thuộc vào trạng thái tuổi của tế bào mẫu nuôi cấy, càng gần trạng thái phôi sinh thì khả năng tái sinh càng lớn. Sau một thời gian nhất định, từ mẫu nuôi cấy bắt đầu xuất hiện các cụm tế bào hoặc cơ quan (chồi, cụm chồi, rễ) hoặc các phôi vô tính có đặc tính gần nhƣ phôi hữu tính. Đối với các mẫu nảy chồi trực tiếp từ thân, cành hoặc rễ củ việc tái sinh chồi dễ dàng hơn.
c. Nhân nhanh chồi
Cần tạo ra tốc độ nhân nhanh cao nhất trong điều kiện nuôi cấy, vì vậy thành phần và điều kiện môi trƣờng phải đƣợc tối ƣu nhằm đạt đƣợc mục tiêu nhân nhanh. Môi trƣờng ở giai đoạn này cần bổ sung các hormone sinh trƣởng (cytokinin, auxin), tăng thời gian chiếu sáng lên từ 16 giờ/ ngày, cƣờng độ ánh sáng tối thiểu là 1000 lux, nhiệt độ thích hợp là từ 20 - 30o
C. Quy trình cấy chuyển nhân nhanh chồi thông thƣờng diễn ra trong khoảng 1-2 tháng tùy từng loại cây. Tỷ lệ nhân nhanh sau mỗi lần cấy chuyển đạt khoảng
2 - 8 lần/ 1 lần cấy chuyển. Giai đoạn nhân nhanh chồi từ một vài chồi ban đầu không nên kéo dài quá lâu để tránh biến dị soma.
d. Tái sinh rễ
Các chồi hình thành trong quá trình nuôi cấy có thể phát rễ tự sinh, nhƣng thông thƣờng các chồi này phải đƣợc cấy chuyển sang một môi trƣờng khác để kích thích tạo rễ. Môi trƣờng tái sinh rễ thƣờng đƣợc bổ sung auxin (NAA, IBA, 2,4 - D) ở liều lƣợng thích hợp.
e. Chuyển cây ra vườn ươm
Các cây nuôi cấy in vitro sau khi đã tái sinh hoàn chỉnh sẽ đƣợc chuyển ra ngoài vƣờn ƣơm. Cây chuyển từ trạng thái dị dƣỡng sang tự dƣỡng. Vì vậy, cần huấn luyện cho cây thích nghi với sự thay đổi của môi trƣờng.