CHƢƠNG 1 : TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU
1.3. Tình hình nghiên cứu nhân giống invitro cây Địa hoàng
1.3.1. Nghiên cứu ngoài nước
Năm 1983, Xu và Davey đã tạo chồi cây Địa hoàng từ các tế bào trần đƣợc thu nhận từ lá cây in vitro. Các tế bào trần đƣợc nuôi cấy phân chia trong môi trƣờng MS lỏng hoặc đặc có chứa 2,0 mg/l NAA và 0,5 mg/l BAP để tạo thành callus, sau đó các callus nảy chồi trong môi trƣờng MS chứa 2,0 mg/l IAA và 1,0 mg/l BAP (Xu, Davey., 1983). [23]
Cũng trong năm 1983, Mao và CS đã nuôi cấy mô phân sinh đỉnh của cây Địa hoàng. Mô phân sinh đỉnh từ 1 - 2 lá cây R. glutinosa đƣợc khử trùng bề mặt và cấy lên môi trƣờng MS bổ sung 0,3 - 0,4 mg/l BA, 0,02 mg/l NAA và 0,1 mg/l GA cho tỷ lệ cây sống đạt 100% và sau 30 ngày cây cho chồi mới. Nhân nhanh chồi trên môi trƣờng MS có bổ sung 2 mg/l BA và rễ đƣợc tạo thành trên môi trƣờng MS bổ sung 0,2 mg/l IAA hoặc không bổ sung (Mao et al., 1983). [24]
Năm 1995, Paek và CS đã nuôi cấy đỉnh chồi và đoạn rễ của cây Địa hoàng. Kết quả cho thấy, chồi đƣợc tạo thành từ các mắt ngủ trong môi trƣờng chứa 1 - 5 mg/l BA, 0,3 mg/l IAA, 0,3% đƣờng và 0,6 - 1,2% Agar. Sự
nhân chồi và tạo rễ đƣợc cải tiến khi bổ sung vào môi trƣờng 0,1 - 0,3% than hoạt tính. Các cây in vitro đƣợc trồng trong giá thể chứa khoáng chất và đá perlite theo tỷ lệ 1:1. Kết quả kiểm tra cây in vivo cũng cho thấy các cây nhân giống in vitro phát triển tốt hơn cây trồng bằng củ, cây trồng không bị nhiễm virus và cho năng suất cao hơn (Paek et al., 1995a; Paek et al., 1995b). [20]
Năm 1999, Park và CS nghiên cứu ảnh hƣởng của các chất điều hòa sinh đến sự nhân mô sẹo và phát sinh chồi. Kết quả cho thấy tỷ lệ nhân mô sẹo đạt 15,4% trong môi trƣờng MS bổ sung 0,2 mg/l NAA và 1,0 mg/l BA. Số lƣợng chồi đƣợc tạo thành tăng từ 1,7 chồi trong môi trƣờng WPM lên 3,4 chồi trong môi trƣờng MS với 0,1 mg/l NAA và 0,5 mg/l BA (Park et al., 1999). [21]
Năm 2002, Xue và CS đã công bố kết quả nghiên cứu môi trƣờng thích hợp nhất và điều kiện tối ƣu cho nuôi cấy củ siêu bi in vitro cây địa hoàng. Chồi in vitro sau khi đƣợc tạo rễ trên môi trƣờng 1/2 MS + 0,1 mg/l IBA, đƣợc cấy vào môi trƣờng thích hợp nhất để tạo củ siêu bi MS + 2 mg/l BAP + 0,1 mg/l NAA + 5% đƣờng trong điều kiện 250C, cƣờng độ ánh sáng 2000- 3000 lux với thời gian chiếu sáng 12 giờ/ngày (Xue et al., 2002). [24]
Năm 2009, Sang Un Park và CS đã nhân giống in vitro từ lá cây Địa hoàng. Kết quả cho thấy chồi phát sinh tốt nhất từ mô lá trong môi trƣờng MS chứa 1 mg/l TDZ + 0,1 mg/l NAA + 3g/l Gelrite (Sang Un Park et al., 2009).
Năm 2012, Xue và CS (2012) nghiên cứu ảnh hƣởng của môi trƣờng, nguồn sucrose, chất điều hòa sinh trƣởng auxin và cytokinin đến quá trình hình thành củ trong ống nghiệm của cây Địa hoàng. Kết quả cho thấy, môi trƣờng 1/4 MS đóng vai trò quan trọng trong quá trình hình thành củ rễ, nồng độ NAA tăng từ 0,05 - 0,15mg/l làm tăng trọng lƣợng trung bình của củ rễ. Khi cây con có rễ dài khoảng 0,5 - 1 cm đƣợc cấy chuyển sang môi trƣờng 1/4 MS bổ sung 1,5 mg/l BA, 1mg/l NAA, 5% sucrose với các nồng độ PP333 khác nhau từ 0 - 3 mg/l. Kết quả cho thấy, sau 3 ngày rễ bắt đầu to lên trong môi trƣờng không có
PP333 và sau 3 ngày trong môi trƣờng có PP333 rễ bắt đầu to lên. Tuy nhiên sau 25 ngày củ rễ trong môi trƣờng không bổ sung PP333 bắt đầu hình thành mô sẹo trong khi đó rễ củ trong môi trƣờng có chứa PP333 rễ tiếp tục to ra mà không hình thành mô sẹo (Xue et al., 2012). [25]
Năm 2013, Aye Aye Thwe và CS khi nghiên cứu ảnh hƣởng của loại môi trƣờng và nồng độ auxin đến sự ra rễ cây Địa hoàng cho thấy trong môi trƣờng môi trƣờng ¼ SH (Schenk and Hildebrandt) không có chất điều hòa sinh trƣởng cây Địa hoàng in vitro ra rễ tốt nhất, số lƣợng rễ đạt 5,3 rễ và chiều dài rễ là 42,3 mm (Aye Thwe et al., 2013). [10]
Năm 2014, theo Ewelina và CS sử dụng TDZ cho hệ số nhân chồi đạt cao hơn các loại cytokinin khác cho 12,25 chồi/mẫu khi nuôi cấy trong môi trƣờng có bổ sung 1,0 mg/l TDZ. Tuy nhiên chất lƣợng chồi không tốt bằng chồi nhân trên môi trƣờng có BAP hoặc Kinetin. Việc bổ sung BAP và Kinetin vào môi trƣờng nuôi cấy làm tăng chất lƣợng chồi, nhƣng giảm hệ số nhân chồi còn 3-4 chồi/mẫu. Nuôi cấy chồi trong môi trƣờng MS bổ sung 0,1 mg/l IAA và 1,0 mg/l BAP sau 2 tuần cây con bắt đầu ra rễ và sau 6 tuần cây hoàn thiện bộ rễ; Nuôi cấy trong hệ thống bioreacter sự ra rễ của chồi tốt hơn nuôi cấy trong ống nghiệm, trong điều kiện này, 93% số chồi cho bộ rễ hoàn chỉnh, trung bình đạt 5,3 rễ/chồi và chiều dài rễ đạt 21 mm. Rễ cũng đƣợc hình thành trong môi trƣờng không có auxin, nhƣng với tần số thấp hơn sau 6 tuần chỉ đạt 65 - 80% số chồi ra rễ và đạt 3 - 5 rễ/chồi. Tất cả các chồi ra rễ đều sống sau 8 tuần huấn luyện cây (Ewelina et al., 2014). [12]
Năm 2015, Ewelina và CS tiếp tục nghiên cứu nhân chồi, phân tích phân tử và các sản phẩm thứ cấp của cây Địa hoàng in vitro, kết quả cho thấy sau 6 tuần nuôi cấy trung bình mỗi callus phát sinh đƣợc 9 chồi trong môi trƣờng MS có bổ sung 1,0 mg/l BAP và 0,1 mg/l IAA (Ewelina et al., 2015).
Năm 2015, Aye Aye Thwe và cs khi nghiên cứu tăng cƣờng khả năng ra rễ cây Địa hoàng bằng Gelling và than hoạt tính cho thấy, môi trƣờng SH
(Schenk and Hildebrandt) bổ sung 3 g/l Gelrite cho số rễ/chồi là 8,2 rễ, chiều dài trung bình rễ là 46,8 mm. [18]. Môi trƣờng SH bổ sung 7 g/l phytagar cho số rễ/chồi là 7,6 rễ và chiều dài trung bình là 45,2 mm. Môi trƣờng SH có chứa 3 g/l Gelrite và 1 g/l than hoạt tính sự phát sinh rễ cây Địa hoàng là tốt nhất, số rễ/ cây đạt 8,8 rễ và chiều dài trung bình rễ là 71,5mm. Cây ra rễ sau 8 tuần nuôi cấy đƣợc mang đi huấn luyện để cây thích nghi với điều kiện bên ngoài. Đầu tiên cây đƣợc rửa sạch cho hết lớp gel, sau đó đƣợc trồng vào chậu đất đã vô trùng và bọc kính bằng túi nilon để tránh mất nƣớc và duy trì độ ẩm, sau 7-15 ngày các túi đƣợc đục lỗ để cây thích nghi dần với môi trƣờng tự nhiên khoảng 2 - 3 ngày, các túi nilon đƣợc loại bỏ hoàn toàn sau 10 - 15 ngày, khi cây con thích nghi hoàn toàn với điều kiện tự nhiên thì cấy đƣợc chuyển ra trồng trong nhà lƣới (Aye Aye Thwe et al., 2015). [13]
1.3.2. Nghiên cứu trong nước
Năm 1994, Phạm Văn Hiển đã nghiên cứu một số biện pháp nâng cao chất lƣợng và số lƣợng giống cây Địa hoàng ở đồng bằng và trung du Bắc bộ. Các kết quả đã đạt đƣợc cho thấy: Củ Địa hoàng hầu nhƣ không có thời gian ngủ nghỉ, chúng mất sức rất nhanh ngay sau khi thu hoạch; Tuổi của củ giống 90 ngày (thu hoạch vào lúc cây vừa ra hoa không qua bảo quản) là nguyên liệu làm giống tốt nhất; Thời vụ làm giống trƣớc vụ trồng dƣợc liệu (vụ thu đông) là 90 - 100 ngày, giống thu xong nên trồng ngay trong vòng 10 ngày; Sử dụng phƣơng pháp tách mầm tốt hơn dùng lát cắt; Xử lý lát cắt Địa hoàng với HA (0,03%) và BAP 10 ppm làm tăng hệ số tạo cây giống và tăng sức sống của cây giống (Phạm Văn Hiển., 1994). [1]
Năm 1995, Nguyễn Trần Hy đã xác định bệnh Virus hoa lá đốm vàng Địa hoàng bằng hiển vi điện tử và nghiên cứu phƣơng pháp nhân giống in vitro cây Địa hoàng. Kết quả cho thấy đã xác định đƣợc bệnh trên Địa hoàng gây thiệt hại 20% vụ hè thu và 50% vụ thu đông (vụ chính) bằng kính HVĐT - JEM T8 là bệnh virus hoa lá đốm vàng. Môi trƣờng tạo cụm chồi là môi
trƣờng MS + 1mg/l BA và môi trƣờng kéo rễ là 1/2 MS + 0,4 mg/l NAA. Các chỉ tiêu sinh học của cây trồng bắt nguồn từ nuôi cấy mô lớn hơn so với đối chứng (Nguyễn Trần Hy., 1995). [3]
Năm 2015, Mai Đăng Hùng đã tiến hành nghiên cứu nuôi cấy in vitro
cây thuốc Địa hoàng. Môi trƣờng tái sinh in vitro là MS + 1,5mg/l BA cho tỉ lệ tạo chồi là 6,67 chồi/mẫu. Môi trƣờng nhân nhanh là MS + 1,0 BA + 0,1 mg/l NAA. Môi trƣờng tạo rễ thích hợp nhất là MS + 0,3 mg/l IBA cho tỉ lệ tạo rễ 100%; Số rễ trung bình trên cây là 7,81, chiều dài rễ là 5,08 cm (Mai Đăng Hùng., 2015). [2]
Các công trình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc đã đánh dấu những bƣớc tiến quan trọng trong quá trình nhân giống Địa hoàng bằng phƣơng pháp
in vitro, làm cơ sở tạo nguồn giống sạch bệnh. Tuy nhiên kết quả còn có những hạn chế: Chƣa đánh giá, lựa chọn giá thể huấn huyện và đánh giá sinh trƣởng, năng suất của cây in vitro ngoài thực địa,… Do vậy, nghiên cứu này sẽ tiến hành giải quyết vấn đề giá thể, điều kiện huấn luyện cây in vitro và đặc điểm giải phẫu, đặc điểm hình thái, sinh trƣởng, năng suất của cây in vitro.