CHƢƠNG 2 : NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nội dung nghiên cứu
2.1.1 Nội dung 1: Nhân giống invitro cây Địa hoàng
- Nghiên cứu xác định môi trƣờng khởi động thích hợp. - Nghiên cứu xác định môi trƣờng nhân chồi thích hợp.
- Nghiên cứu xác định môi trƣờng cho sự ra rễ cây Địa hoàng in vitro
hoàn chỉnh.
- Nghiên cứu loại giá thể ra cây thích hợp.
2.1.2. Nội dung 2: Đặc điểm hình thái, giải phẫu, sinh trưởng cây Địa hoàng in vitro
- Đánh giá đặc điểm hình thái, giải phẫu cây Địa hoàng in vitro.
- Đánh giá khả năng sinh trƣởng, năng suất cây Địa hoàng in vitro.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Nội dung 1: Nhân giống in vitro cây Địa hoàng
2.2.1.1 Phương pháp vào mẫu a. Lựa chọn cây mẹ
Chọn những cây mẹ sinh trƣởng phát triển tốt làm cây mẹ vào mẫu. Cây mẹ đƣợc lấy tại địa điểm trồng Phú Thọ và đƣợc kiểm tra virus TMV và CMV tại Viện Di truyền nông nghiệp Việt Nam. Những cây sạch virus đƣợc sử dụng là vật liệu vào mẫu.
b. Phương pháp khử trùng mẫu:
Củ Địa hoàng đƣợc rửa sạch bằng dung dịch xà phòng 5% dƣới vòi nƣớc chảy và rửa lại bằng nƣớc cất nhiều lần trƣớc khi tiến hành khử trùng trong box cấy. Mẫu củ đƣợc khử trùng bề mặt bằng cồn 70o trong 30 giây sau đó khử trùng bằng HgCl2 0,1% 2 lần tổng thời gian 15 phút, sau đó rửa lại nhiều lần bằng nƣớc cất vô trùng, cắt thành những đoạn ngắn 1 - 2 cm và cấy vào môi trƣờng nền.
c. Điều kiện nuôi cấy:
Môi trƣờng khử trùng ở 1 atm, 121oC trong 15 phút PH môi trƣờng 5,6 - 5,8.
Nhiệt độ phòng nuôi 25 ± 2oC. Cƣờng độ chiếu sáng 2000 lux
Thời gian chiếu sáng: 16 giờ/ngày đêm
2.2.1.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm
a. Nghiên cứu xác định môi trường nền vào mẫu thích hợp
Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy đến sự tái sinh chồi
Mẫu khử trùng đƣợc cấy vào các môi trƣờng cơ bản khác nhau có bổ sung 3% sucrose, để đánh giá sự tái sinh chồi của mẫu theo các công thức thí nghiệm.
Công thức 1: Môi trƣờng MS. Công thức 2: Môi trƣờng Knudson. Công thức 3: Môi trƣờng VW.
+ Chỉ tiêu theo dõi: Số mẫu tái sinh chồi và số chồi/mẫu. + Thời điểm đánh giá: Sau 4 tuần nuôi cấy
b. Nghiên cứu xác định môi trường nhân chồi thích hợp
Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của Cytokinin đến sự nhân chồi Địa hoàng
Vật liệu tạo ra ở thí nghiệm trên đƣợc sử dụng để nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ BAP hoặc Kinetin đến sự nhân chồi in vitro. Thí nghiệm đƣợc bố trí trên môi trƣờng MS (Murashige and Skoog) bổ sung 3% sucrose, 7g/l agar, pH 5,8 và bổ sung Cytokinin theo các công thức:
CT1 (đối chứng): MS CT2: MS + 0,3 mg/l BAP CT3: MS + 0,5 mg/l BAP CT4: MS + 1,0 mg/l BAP CT5: MS + 1,5 mg/l BAP
CT6: MS + 0,3 mg/l Kinetin CT7: MS + 0,5 mg/l Kinetin CT8: MS + 1,0 mg/l Kinetin CT9: MS + 1,5 mg/l Kinetin
+ Chỉ tiêu theo dõi: Hệ số nhân chồi và chiều cao chồi. + Thời điểm đánh giá: Sau 4 tuần nuôi cấy.
Thí nghiệm 3: Ảnh hƣởng tái tổ hợp BAP và IAA đến sự nhân chồi
CT10: MS + 1 g/l PVP + 1,0 mg/l BAP CT11: MS + 1 g/l PVP + 1,0 mg/l BAP + 0,1 mg/l IAA CT12: MS + 1 g/l PVP + 1,0 mg/l BAP + 0,2 mg/l IAA CT13: MS + 1 g/l PVP + 1,0 mg/l BAP + 0,3 mg/l IAA CT14: MS + 1 g/l PVP + 1,0 mg/l BAP + 0,4 mg/l IAA CT15: MS + 1 g/l PVP + 1,0 mg/l BAP + 0,5 mg/l IAA + Chỉ tiêu theo dõi: Hệ số nhân chồi và chiều cao chồi. + Thời điểm đánh giá: Sau 4 tuần nuôi cấy.
c. Nghiên cứu môi trường ra rễ tạo cây Địa hoàng in vitro hoàn chỉnh
Thí nghiệm 4: Ảnh hƣởng của nồng độ Auxin đến sự tạo rễ cây Địa hoàng
Các chồi đạt tiêu chuẩn ra rễ đƣợc cấy sang môi trƣờng tạo rễ bổ sung 3% sucrose, 7g/l agar, pH 5,8 và bổ sung Auxin theo các công thức sau.
CT1 (đối chứng): MS CT2: MS + 0,3 mg/l NAA CT3: MS + 0,5 mg/l NAA CT4: MS + 1,0 mg/l NAA CT5: MS + 1,5 mg/l NAA CT6: MS + 0,1 mg/l IAA CT7: MS + 0,3 mg/l IAA CT8: MS + 0,5 mg/l IAA
CT9: MS + 1,0 mg/l IAA
+ Chỉ tiêu theo dõi: Số cây ra rễ, số rễ/cây, chiều dài rễ và chiều cao cây. + Thời điểm đánh giá: Sau 4 tuần nuôi cấy
Thí nghiệm 5: Ảnh hƣởng phối hợp PVP và nồng độ Auxin đến sự tạo rễ cây Địa hoàng Công thức 10: 1/2MS + 1,0 g/l PVP Công thức 11: 1/2MS + 1,0 g/l PVP + 0,3 mg/l NAA Công thức 12: 1/2MS + 1,0 g/l PVP + 0,5 mg/l NAA Công thức 13: 1/2MS + 1,0 g/l PVP + 1,0 mg/l NAA Công thức 14: 1/2MS + 1,0 g/l PVP + 1,5 mg/l NAA Công thức 15: 1/2MS + 1,0 g/l PVP + 0,1 mg/l IAA Công thức 16: 1/2MS + 1,0 g/l PVP + 0,3 mg/l IAA Công thức 17: 1/2MS + 1,0 g/l PVP + 0,5 mg/l IAA Công thức 18: 1/2MS + 1,0 g/l PVP + 1,0 mg/l IAA
+ Chỉ tiêu theo dõi: Số cây ra rễ, số rễ/cây, chiều dài rễ và chiều cao cây. + Thời điểm đánh giá: Sau 4 tuần nuôi cấy
Thí nghiệm 6: Ảnh hƣởng phối hợp giữa Auxin và Cytokinin đến sự tạo rễ cây Địa hoàng
Các chồi đạt tiêu chuẩn ra rễ đƣợc cấy sang môi trƣờng tạo rễ 1/4MS bổ sung 1,5 mg/l BAP, 3% sucrose, 7g/l agar, pH 5,8 (theo Xue và cs., 2012) và bổ sung Auxin theo các công thức sau.
CT19 (đối chứng): 1/4MS + 1,0 mg/l BAP CT20: 1/4MS +1,0 mg/l BAP + 0,5 mg/l NAA CT21: 1/4MS +1,0 mg/l BAP +1,0 mg/l NAA CT22: 1/4MS +1,0 mg/l BAP +1,5 mg/l NAA CT23: 1/4MS +1,0 mg/l BAP +2,0mg/l NAA CT24: 1/4MS +1,0 mg/l BAP + 0,2 mg/l IAA CT25: 1/4MS +1,0 mg/l BAP + 0,4 mg/l IAA
CT26: 1/4MS +1,5 mg/l BAP + 0,6 mg/l IAA CT27: 1/4MS +1,5 mg/l BAP + 0,8 mg/l IAA CT28: 1/4MS +1,5 mg/l BAP +1,0 mg/l IAA
+ Chỉ tiêu theo dõi : Số cây ra rễ, số rễ/cây, chiều dài rễ và chiều cao cây + Thời điểm đánh giá: Sau 4 tuần nuôi cấy.
d. Nghiên cứu loại giá thể ra cây thích hợp
Thí nghiệm 7: Ảnh hƣởng của loại giá thể trồng đến tỷ lệ sống và sinh trƣởng của cây con giai đoạn ra ngôi
CT1: 50% đất phù sa + 50% cát CT2: 50% đất phù sa + 50% trấu hun
CT3: Giá thể hỗn hợp: Lớp trên cùng là cát khô sạch 3 - 4 cm, lớp tiếp theo là phân hữu cơ (đã sàng qua rây) trộn với đất pha cát theo tỷ lệ 3:2.
CT4: 100% trấu hun
CT5: Phân hữu cơ vi sinh 90% + đá perlite 10%.
+ Chế độ chăm sóc: Cây đƣợc huấn luyện trong nhà lƣới che sáng từ 25 - 50%, chế độ tƣới phun mù đảm bảo luôn giữ ẩm cho cây và giá thể.
+ Chỉ tiêu đánh giá: Tỷ lệ cây sống, số lá/cây, chiều cao cây và chiều dài lá. + Thời điểm đánh giá: Sau 4 tuần ra cây.
2.2.2. Nội dung 2: Đặc điểm hình thái, giải phẫu, sinh trưởng, năng suất cây Địa hoàng in vitro
2.2.2.1 Đặc điểm hình thái
Cây Địa hoàng in vitro đã đƣợc huấn luyện và đủ tiêu chuẩn xuất vƣờn: Cây cao 10 - 12 cm, có từ 5 lá trở lên, lá có màu xanh đậm, phiến lá dày. Đƣờng kính gốc 1,5 - 3 mm. Cây sinh trƣởng tốt, không nhiễm sâu bệnh. Cây đƣợc tiến hành trồng ngoài thực địa theo quy trình kỹ thuật của Viện Dƣợc liệu (2005).
Tiến hành theo dõi các chỉ tiêu:
- Lá: Dạng lá, màu sắc lá, phiến lá, kích thƣớc lá (đo bằng thƣớc dài (cm))
- Củ: Màu sắc vỏ củ, màu sắc thịt củ, đƣờng kính củ (đo bằng thƣớc kẹp palme (cm)), chiều dài củ (đo bằng thƣớc dài (cm))
- Chiều cao cây: Đo bằng thƣớc dài (cm)
2.2.2.2. Đặc điểm giải phẫu
Gồm các chỉ tiêu: Cấu tạo thứ cấp của rễ (củ), cấu tạo thứ cấp của thân, cấu tạo lá. Phƣơng pháp làm tiêu bản vi phẫu thực vật và nghiên cứu cấu tạo trong của thực vật theo Nguyễn Bá (1997).
2.2.2.3. Khả năng sinh trưởng, năng suất cây Địa hoàng in vitro
- Địa điểm: Khu vực trồng thử nghiệm cây Địa hoàng in vitro tại vƣờn ƣơm khu 15, xã Hồng Đà, huyện Tam Nông, tỉnh Phú Thọ
- Diện tích: 300m2
+ Mô hình thí nghiệm: Chọn cây giống nuôi cấy mô sau khi đƣợc huấn luyện khỏe mạnh, không bị sâu bệnh hại. Cây có chiều cao trung bình 10 - 12cm; Có từ 5 lá trở lên, lá có màu xanh đậm, phiến lá dày dặn. Diện tích 200 m2
+ Mô hình đối chứng: Trồng từ củ giống bằng phƣơng pháp nhân giống vô tính (lát cắt củ). Diện tích 100 m2
- Thời gian: Tháng 8/2019 - 2/2020 - Quy trình kỹ thuật:
+ Chuẩn bị đất: Đất trồng cần loại đất có thành phần cơ giới nhẹ, tơi xốp, giàu chất dinh dƣỡng, có tầng canh tác dày, giữ nƣớc và thoát nƣớc tốt, đất đồi có độ dốc 5 - 10o. Độ pH thích hợp sẽ cho Địa hoàng sinh trƣởng phát triển tốt từ 5,5 - 7,0.
Làm đất tơi xốp và lên luống rộng 0,8 - 1,0m, cao 30 - 40 cm, mặt luống đƣợc làm phẳng và có độ dốc hƣớng ra 2 bên mép luống.
hàng cách hàng 30 cm
+ Bón phân:
Lƣợng phân bón:
- Phân hữu cơ vi sinh hoặc phân giun quế: 360 kg/1 sào BB (360m2) - Đạm: 15kg/1 sào BB (360m2)
- Lân: 15kg/1 sào BB (360m2) - Kali: 10kg/1 sào BB (360m2)
- Vôi bột: 12,5 kg/1 sào BB (360m2) (Dùng để bón trong quá trình làm đất)
Bón lót trƣớc khi trồng: 100% hữu cơ vi sinh hoặc phân giun quế, 100% lân, đƣợc bón vào các hốc, trộn đều phân với đất.
Bón thúc:
Lần 1: Sau khi trồng đƣợc 30 ngày bón thúc 1/2 đạm + 1/4 kali Lần 2: Sau khi trồng đƣợc 45 - 50 ngày thúc 1/2 đạm + 1/2 kali. Lần 3: Sau trồng 80 - 90 ngày, bón thúc 1/4 kali
+ Phòng trừ sâu bệnh: Thƣờng xuyên kiểm tra đồng ruộng phát hiện sớm sâu bệnh hại. Một số sâu bệnh hại chủ yếu trên cây Địa hoàng là sâu xám, sâu xanh, bệnh lở cổ rễ, bệnh thối gốc. Áp dụng biện pháp phòng trừ tổng hợp (IPM) để quản lý sâu bệnh hại trên cây Địa hoàng. Chỉ sử dụng các loại thuốc được quy định trong thông tư 10/2019/TT-BNNPTNT, ngày 20/9/2019 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn về việc ban hành Danh mục thuốc bảo vệ thực vật được phép sử dụng, cấm sử dụng tại Việt Nam
+ Thu hoạch: Khi cây đƣợc 5 - 6 tháng tuổi (bộ lá chuyển sang màu tím) chọn thời tiết thích hợp để thu hoạch, tránh thu hoạch vào ngày mƣa để không bị thối hỏng. Khi thu hoạch cần cắt bỏ thân lá và đào lấy củ nhẹ nhàng, tránh sây sát vì củ rất giòn và dễ gãy.
Số lƣợng củ/cây (củ): Đếm số củ trên cây
Khối lƣợng củ/cây (củ): Cân toàn bộ số củ trên cây
Khối lƣợng củ/ô (kg/ô): Cân khối lƣợng củ trên từng ô theo dõi Năng suất củ (tấn/ha)
Hình 2.1. Vào mẫu
Hình 2.4. Kiểm tra cây con đƣa ra huấn luyện
Hình 2.6. Huấn luyện cây
Hình 2.8. Cây giống đem trồng 2.3. Phƣơng pháp xử lý số liệu
Các thí nghiệm đều đƣợc bố trí ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại.
Số liệu đƣợc xử lý theo chƣơng trình Microsoft excel và Irristart 5.0 trên máy vi tính.
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Nhân giống in vitro cây Địa hoàng
3.1.1. Môi trường khởi động thích hợp
Các mẫu củ Địa hoàng đã lựa chọn đƣợc khử trùng sạch và cấy vào các môi trƣờng khởi động khác nhau để theo dõi sự nảy mầm của củ trong từng loại môi trƣờng, mỗi công thức thí nghiệm thực hiện 150 mẫu (50 mẫu/lần nhắc). Kết quả sau 4 tuần vào mẫu đƣợc thể hiện trong bảng 3.1.
Bảng 3.1. Ảnh hƣởng của môi trƣờng nền đến sự nảy chồi củ Địa hoàng
CT Môi trƣờng nền Số mẫu nảy chồi Tỷ lệ mẫu nảy chồi (%) Số mẫu hỏng Tỷ lệ mẫu hỏng (%) Số chồi/mẫu 1 MS 28,00a 56,00% 22,00c 44,00% 5,02a 2 Knudson 15,33b 30,66% 34,67b 69,34% 4,12a 3 VW 12,33c 24,66% 37,67a 75,34% 3,69c
Ghi chú: a, b, c: Khác biệt có ý nghĩa thống kê theo từng cột (P ≤ 0,05)
Kết quả bảng 3.1 cho thấy, cả 3 loại môi trƣờng nền thử nghiệm củ Địa hoàng đều nảy chồi, tuy nhiên sự nảy chồi trong các môi trƣờng là khác nhau. Môi trƣờng MS cho số mẫu nảy chồi 28/50 mẫu chiếm 56%, số chồi/ mẫu là 5,02 chồi là môi trƣờng tốt nhất cho sự nảy chồi Địa hoàng. Môi trƣờng Knudson có số mẫu nảy chồi 15,33 mẫu tƣơng ứng 30,66%, số chồi/mẫu là 4,12 chồi. Môi trƣờng VW cho kết quả thấp nhất có số mẫu nảy chồi 12,33 mẫu tƣơng ứng 24,66%, số chồi/mẫu là 3,69 chồi. Sự khác biệt về số mẫu nảy chồi, chồi chồi/mẫu của cả 3 loại môi trƣờng đều có ý nghĩa thống kê (P ≤ 0,05).
Các nghiên cứu nhân giống in vitro cây Địa hoàng đa số cũng sử dụng môi trƣờng MS là môi trƣờng cơ bản, tùy từng mục đích nuôi cấy mà bổ sung thêm các chất điều hòa sinh trƣởng khác nhau nhƣ sử dụng môi trƣờng MS để
nuôi cấy tế bào trần từ lá Địa hoàng (Xu, Davey., 1983). Nuôi cấy mô phân sinh đỉnh cây Địa hoàng trong môi trƣờng MS (Mao et al., 1983). Chồi Địa hoàng phát sinh tốt nhất từ lá trong môi trƣờng MS chứa 1 mg/l TDZ + 0,1 mg/l NAA + 3g/l Gelrite (Sang Un Park et al., 2009). Chồi phát sinh từ callus trong môi trƣờng MS có bổ sung 1,0 mg/l BAP và 0,1 mg/l IAA (Ewelina et al., 2015). Cũng có một số tác giả nhân giống Địa hoàng sử dụng môi trƣờng SH (Aye Thwe et al., 2013, 2015). [9]
Hình 3.1. Sự nảy chồi in vitro củ Địa hoàng trong các môi trƣờng nuôi cấy
3.1.2. Môi trường nhân chồi thích hợp
Nhằm nhân số lƣợng lớn chồi in vitro trong phòng thí nghiệm, trong môi trƣờng nuôi cấy thƣờng đƣợc bổ sung các loại chất điều hòa sinh trƣởng khác nhau, đặc biệt là những chất thuộc nhóm Cytokinin. Cytokinin là nhóm chất điều hòa sinh trƣởng có tác dụng kích thích sự phân chia tế bào, sự hình thành và sinh trƣởng của chồi in vitro (Miller., 1961). Trong nghiên cứu này các loại cytokinin đƣợc sử dụng là BAP, Kinetin và IAA đƣợc sử dụng riêng rẽ hoặc phối hợp với nhau trong các công thức thí nghiệm. [16]
3.1.2.1. Ảnh hưởng của loại Cytokinin đến sự nhân chồi Địa hoàng
Các chồi Địa hoàng kích thƣớc 2 - 3 cm đƣợc cắt bỏ lá và cấy vào môi trƣờng nhân chồi theo các công thức thí nghiệm khác nhau với nồng độ BAP là 0,3; 0,5; 1,0 và 1,5 mg/l, nồng độ Kinetin là 0,3; 0,5; 1,0 và 1,5 mg/l và công
thức đối chứng không bổ sung chất điều hòa sinh trƣởng. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của BAP và Kinetin đến sự nhân chồi sau 4 tuần cấy mẫu đƣợc thể hiện trong bảng 3.2.
Kết quả bảng 3.2 cho thấy, cả hai chất điều hòa sinh trƣởng BAP và Kinetin đều ảnh hƣởng đến hệ số nhân chồi và chiều cao chồi của Địa hoàng trong đó BAP cho kết quả nhân chồi tốt hơn cụ thể là BAP ở nồng độ 1,0 mg/l cho kết quả tốt nhất trong các công thức thí nghiệm, hệ số nhân chồi là 3,09 lần, chiều cao trung bình chồi là 3,5 cm. BAP ở nồng độ 1,5 mg/l hệ số nhân chồi là 2,90 lần, chiều cao chồi là 3,22 cm. Nồng độ BAP cao hoặc giảm xuống thấp 0,3 - 0,5 mg/l hệ số nhân chồi và chiều cao chồi đều giảm, khi