PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
3.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5.1. Phương pháp lấy mẫu
Mẫu máu (gà thuộc tất cả các lứa tuổi từ≥3 tuần tuổi đến hơn >150 ngày tuổi) chưa từng chủng vacxin aMPV, mẫu bệnh phẩm gà có biểu hiện sưng phù đầu (khí quản, phổi, buồng trứng, thận) được lấy theo phương pháp của QCVN 01- 83: 2011/BNNPTNT. Sau đó mẫu được tách chiết lấy huyết thanh.
Mẫu huyết thanh đại diện cho các địa phương, giống loài, loại hình chuồng trại, quy mô chăn nuôi, theo các lứa tuổi. Trong nghiên cứu này, các loại gà theo đặc điểm di truyền đã được lựa chọn phân nhóm tuổi theo các giai đoạn sinh trưởng chính để lấy mẫu: gà giò (22-42 ngày tuổi), với gà thịt do đặc điểm chu kỳ nuôi là khác nhau, nên giai đoạn vỗ béo nghiên cứu khảo sát thành các giai đoạn 43-90 ngày tuổi (tất cả các loại gà); 91-120 ngày tuổi (gà lai gà bản địa) và gà nuôi >120 ngày tuổi (chỉ thực hiện ở gà bản địa).
Để phát hiện tỷ lệ lưu hành virus ở đàn gà nuôi tại miền Bắc Việt Nam, thiết kế lấy mẫu bệnh phẩm nghiên cứu bằng phương pháp lấy mẫu ngẫu nhiên đơn giản, và phân tầng.
Mỗi trang trại được lấy tư 7-21 mẫu/trang trại.
3.5.2. Phương pháp tách ARN
ARN được tách từ huyễn dịch bệnh phẩm 10%, các bước thực hiện như sau:
Bước 1: Ly giải mẫu
- Bổ sung 800µl dung dịch Trizol vào 200µl huyễn dịch virus, vortex; - Bổ sung tiếp 200µl Chloroform, vortex mạnh trong 15 giây. Ủ ở nhiệt độ phòng 5 phút.
Bước 2: Giải phóng ARN
- Huyễn dịch trên được ly tâm 12.000 vòng/ phút trong 10 phút ở 4oC; - Chuyển pha trên có chứa ARN vào một ống Eppendorf mới (500µl).
Bước 3: Kết tủa ARN
- Bổ sung 500µl dung dịch Isopropanol, tủa ở -20oC/10 phút;
- Ly tâm 12000 vòng/ phút/10 phút ở 4oC, bỏ dịch trên, thu tủa ARN.
Bước 4: Rửa phần tủa
- Ly tâm 12000 vòng/ phút trong 10 phút ở 4oC.
Bước 5: Hoàn nguyên tủa và thu ARN
- Loại bỏ phần dịch phía trên;
- Hòa ARN trong 30µl nước cất 3 lần đã xử lý RNase và bảo quản ở -70oC.
3.5.3. Phương pháp tổng hợp cDNA
cDNA được tổng hợp bằng kít MMLV, sử dụng random hexamers. Điều kiện nhiệt độ của phản ứng được tuân thủ theo hướng dẫn của nhà sản xuất như sau:
Trộn 10μl ARN vớii 2μl mồi Random hexamer, ly tâm nhẹvà để trong máy PCR với chu trình nhiệt 70oC trong vòng 5 phút, sau đó lấy ra thêm vào 4μl 5X First Strand buffer, 2μl DDT, 1μl dNTP, 1μl M-MLV RT đồng nhất mẫu và để trong máy PCR với chu trình nhiệt 37oC -1 giờ và 70oC - 15 phút.
3.5.4. Phương pháp RT-PCR phát hiện và định aMPV
Giám định aMPV trong mẫu bệnh phẩm được thực hiện qua 2 bước: (i) định tính có/ không có aMPV bằng cặp mồi đặc hiệu chung cho 4 subtype; (ii) thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu cho aMPV/A, aMPV/B, aMPV/C và aMPV/D. Trình tự mồi (bảng 3.1) được thừa hưởng từ các nghiên cứu trước đây (Bayon-Auboyer & cs., 1999).
Bảng 3.1. Trình tự mồi đặc hiệu giám định và định aMPV
Tên
mồi Gen đích Trình tự (5’-3’) Tác giả
Ga G CCG GGA CAA GTA TCT CTA TGG Bayon-Auboyer
& cs. (1999)
Gy G TCT CGC TGA CAA ATT GGT CCT GA
Phản ứng PCR với cặp mồi Ga/Gy đã được tối ưu nồng độ mồi và nhiệt độ mồi, sử dụng đối chứng dương là virus tham chiếu chủng PL21 trong vacxin Nemovac. Thành phần phản ứng PCR (20μl) được phối trộn theo hướng dẫn của nhà sản xuất, trong đó: 17μl nước 3D + 1μl mồi Ga + 1μl mồi Gy + 1μl cDNA mẫu tách chiết.
Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR được tóm tắt như sau: (i) 94oC trong 2 phút; (ii) 35 chu kì (94oC trong 20 giây, 50oC trong 30 giây, 72oC trong 30 giây); (iii) 72oC trong 5 phút.
Sản phẩm PCR được phân tích bằng phương pháp điện di trong thạch agarose 1,5%, có bổ sung dung dịch nhuộm RedsafeTM.
3.5.5. Phương pháp phân tích trình tự gen
Sản phẩm RT-PCR sau khi được tinh sạch và giải trình tự (theo hai là chiều xuôi, chiều ngược) bằng phương pháp Sanger, được thực hiện bởi công ty 1st BASE (Malaysia). Các phần mềm tin sinh học chuyên dụng như BioEdit, DnaSP được dùng để xác định đặc các điểm của trình tự gen như: % tương đồng trình tựnucleotide, % tương đồng trình tự amino acid, đa hình nucleotide, các vị trí có đột biến thêm- xóa, các vị trí/ trình tự nucleotide bảo thủ, codon usage bias, v.v...
Phần mềm MEGA và BEAST được sử dụng để xây dựng cây phát sinh chủng loại dựa vào các gen mã hóa protein của mỗi loại virus, dựa trên cơ sở dữ liệu là các trình tự gen đã công bố tại GenBank. Thuật toán dựng cây phát sinh chủng loại là Neighbor joining hoặc Maximum likelihood, với số lần thực hiện phân tích bootstrap là 1000 lần. Biểu diễn và hiệu chỉnh cây phát sinh chủng loại bằng phần mềm FigTree v1.4.3.
3.5.6. Phương pháp ELISA gián tiếp
Kháng thểđặc hiệu kháng aMPV được phát hiện bằng phương pháp ELISA gián tiếp, sử dụng bộ kít Kit ELISA ID Screen Avian Metapneumovirus Indirect 5P (IDVET_MPVS-5P, IDvet).. Pha loãng huyết thanh và các bước thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Qui trình được thực hiện tóm tắt các bước như sau:: (i) pha loãng mẫu với Dilution Buffer, thêm vào đĩa; (ii) ủ trong 30 phút ở nhiệt độ phòng, rửa bằng Wash solution; (iii) thêm Conjugate 1X; (iv) ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng, rửa; (v) thêm Substrate Solution; (vi) ủ 15 phút ở nhiệt độ phòng, chú ý tránh ánh sáng; (vii) thêm Stop solution để dừng phản ứng. Kết quả được đọc ở bước sóng 450nm. Sự có mặt của kháng thể kháng aMPV trong các mẫu huyết thanh được xác định bằng mật độ quang (OD- optical density) trên cơ sở tính toán tỷ số dương tính (S/P). Nếu S/P ≤0,20 được xem là mẫu dương tính. Giá trị hiệu giá kháng thể(Titer) được tính theo công thức như sau:
Log10(titer)=1,09 * log10 (S/P) + 3,360 Hiệu giá kháng thể= 10 log
3.5.7. Phương pháp nghiên cứu dịch tễ học
Phương pháp dịch tễ học mô tả: Được sử dụng để nghiên cứu các đặc điểm dương tính huyết thanh học theo các đặc điểm địa phương, giống loài, lứa tuổi, loại hình chuồng trại, quy mô.
Các mẫu được mã hóa kết hợp với thông tin được thu thập về các yếu tố như: địa phương, giống loài, loại hình chuồng trại, quy mô chăn nuôi, tình trạng sử dụng vacxin phòng vac xin aMPV, biểu hiện triệu chứng, bệnh tích.
3.5.8. Xử lý số liệu
Tỷ lệlưu hành của virus được tính toán các tiêu chí: lứa tuổi, loại hình chăn nuôi, địa điểm, v.v... Các bước tính toán và phân tích thống kê được thực hiện trên phần mềm Excel, Minitab 17, SPSS. Các phép tính thống kê được sử dụng là t-test, one-way ANOVA. Giá trị p < 0,05 được xác định là giới hạn sai khác có ý nghĩa thống kê.