L ỜI CẢM ƠN
3.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5.1. Phương pháp lấy mẫu
Mẫu máu (gà thuộc tất cả các lứa tuổi từ≥3 tuần tuổi đến hơn >150 ngày tuổi) chưa từng chủng vacxin aMPV, mẫu bệnh phẩm gà có biểu hiện sưng phù đầu (khí quản, phổi, buồng trứng, thận) được lấy theo phương pháp của QCVN 01- 83: 2011/BNNPTNT. Sau đó mẫu được tách chiết lấy huyết thanh.
Mẫu huyết thanh đại diện cho các địa phương, giống loài, loại hình chuồng trại, quy mô chăn nuôi, theo các lứa tuổi. Trong nghiên cứu này, các loại gà theo đặc điểm di truyền đã được lựa chọn phân nhóm tuổi theo các giai đoạn sinh trưởng chính để lấy mẫu: gà giò (22-42 ngày tuổi), với gà thịt do đặc điểm chu kỳ nuôi là khác nhau, nên giai đoạn vỗ béo nghiên cứu khảo sát thành các giai đoạn 43-90 ngày tuổi (tất cả các loại gà); 91-120 ngày tuổi (gà lai gà bản địa) và gà nuôi >120 ngày tuổi (chỉ thực hiện ở gà bản địa).
Để phát hiện tỷ lệ lưu hành virus ở đàn gà nuôi tại miền Bắc Việt Nam, thiết kế lấy mẫu bệnh phẩm nghiên cứu bằng phương pháp lấy mẫu ngẫu nhiên đơn giản, và phân tầng.
Mỗi trang trại được lấy tư 7-21 mẫu/trang trại.
3.5.2. Phương pháp tách ARN
ARN được tách từ huyễn dịch bệnh phẩm 10%, các bước thực hiện như sau:
Bước 1: Ly giải mẫu
- Bổ sung 800µl dung dịch Trizol vào 200µl huyễn dịch virus, vortex; - Bổ sung tiếp 200µl Chloroform, vortex mạnh trong 15 giây. Ủ ở nhiệt độ phòng 5 phút.
Bước 2: Giải phóng ARN
- Huyễn dịch trên được ly tâm 12.000 vòng/ phút trong 10 phút ở 4oC; - Chuyển pha trên có chứa ARN vào một ống Eppendorf mới (500µl).
Bước 3: Kết tủa ARN
- Bổ sung 500µl dung dịch Isopropanol, tủa ở -20oC/10 phút;
- Ly tâm 12000 vòng/ phút/10 phút ở 4oC, bỏ dịch trên, thu tủa ARN.
Bước 4: Rửa phần tủa
- Ly tâm 12000 vòng/ phút trong 10 phút ở 4oC.
Bước 5: Hoàn nguyên tủa và thu ARN
- Loại bỏ phần dịch phía trên;
- Hòa ARN trong 30µl nước cất 3 lần đã xử lý RNase và bảo quản ở -70oC.
3.5.3. Phương pháp tổng hợp cDNA
cDNA được tổng hợp bằng kít MMLV, sử dụng random hexamers. Điều kiện nhiệt độ của phản ứng được tuân thủ theo hướng dẫn của nhà sản xuất như sau:
Trộn 10μl ARN vớii 2μl mồi Random hexamer, ly tâm nhẹvà để trong máy PCR với chu trình nhiệt 70oC trong vòng 5 phút, sau đó lấy ra thêm vào 4μl 5X First Strand buffer, 2μl DDT, 1μl dNTP, 1μl M-MLV RT đồng nhất mẫu và để trong máy PCR với chu trình nhiệt 37oC -1 giờ và 70oC - 15 phút.
3.5.4. Phương pháp RT-PCR phát hiện và định aMPV
Giám định aMPV trong mẫu bệnh phẩm được thực hiện qua 2 bước: (i) định tính có/ không có aMPV bằng cặp mồi đặc hiệu chung cho 4 subtype; (ii) thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu cho aMPV/A, aMPV/B, aMPV/C và aMPV/D. Trình tự mồi (bảng 3.1) được thừa hưởng từ các nghiên cứu trước đây (Bayon-Auboyer & cs., 1999).
Bảng 3.1. Trình tự mồi đặc hiệu giám định và định aMPV
Tên
mồi Gen đích Trình tự (5’-3’) Tác giả
Ga G CCG GGA CAA GTA TCT CTA TGG Bayon-Auboyer
& cs. (1999)
Gy G TCT CGC TGA CAA ATT GGT CCT GA
Phản ứng PCR với cặp mồi Ga/Gy đã được tối ưu nồng độ mồi và nhiệt độ mồi, sử dụng đối chứng dương là virus tham chiếu chủng PL21 trong vacxin Nemovac. Thành phần phản ứng PCR (20μl) được phối trộn theo hướng dẫn của nhà sản xuất, trong đó: 17μl nước 3D + 1μl mồi Ga + 1μl mồi Gy + 1μl cDNA mẫu tách chiết.
Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR được tóm tắt như sau: (i) 94oC trong 2 phút; (ii) 35 chu kì (94oC trong 20 giây, 50oC trong 30 giây, 72oC trong 30 giây); (iii) 72oC trong 5 phút.
Sản phẩm PCR được phân tích bằng phương pháp điện di trong thạch agarose 1,5%, có bổ sung dung dịch nhuộm RedsafeTM.
3.5.5. Phương pháp phân tích trình tự gen
Sản phẩm RT-PCR sau khi được tinh sạch và giải trình tự (theo hai là chiều xuôi, chiều ngược) bằng phương pháp Sanger, được thực hiện bởi công ty 1st BASE (Malaysia). Các phần mềm tin sinh học chuyên dụng như BioEdit, DnaSP được dùng để xác định đặc các điểm của trình tự gen như: % tương đồng trình tựnucleotide, % tương đồng trình tự amino acid, đa hình nucleotide, các vị trí có đột biến thêm- xóa, các vị trí/ trình tự nucleotide bảo thủ, codon usage bias, v.v...
Phần mềm MEGA và BEAST được sử dụng để xây dựng cây phát sinh chủng loại dựa vào các gen mã hóa protein của mỗi loại virus, dựa trên cơ sở dữ liệu là các trình tự gen đã công bố tại GenBank. Thuật toán dựng cây phát sinh chủng loại là Neighbor joining hoặc Maximum likelihood, với số lần thực hiện phân tích bootstrap là 1000 lần. Biểu diễn và hiệu chỉnh cây phát sinh chủng loại bằng phần mềm FigTree v1.4.3.
3.5.6. Phương pháp ELISA gián tiếp
Kháng thểđặc hiệu kháng aMPV được phát hiện bằng phương pháp ELISA gián tiếp, sử dụng bộ kít Kit ELISA ID Screen Avian Metapneumovirus Indirect 5P (IDVET_MPVS-5P, IDvet).. Pha loãng huyết thanh và các bước thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Qui trình được thực hiện tóm tắt các bước như sau:: (i) pha loãng mẫu với Dilution Buffer, thêm vào đĩa; (ii) ủ trong 30 phút ở nhiệt độ phòng, rửa bằng Wash solution; (iii) thêm Conjugate 1X; (iv) ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng, rửa; (v) thêm Substrate Solution; (vi) ủ 15 phút ở nhiệt độ phòng, chú ý tránh ánh sáng; (vii) thêm Stop solution để dừng phản ứng. Kết quả được đọc ở bước sóng 450nm. Sự có mặt của kháng thể kháng aMPV trong các mẫu huyết thanh được xác định bằng mật độ quang (OD- optical density) trên cơ sở tính toán tỷ số dương tính (S/P). Nếu S/P ≤0,20 được xem là mẫu dương tính. Giá trị hiệu giá kháng thể(Titer) được tính theo công thức như sau:
Log10(titer)=1,09 * log10 (S/P) + 3,360 Hiệu giá kháng thể= 10 log
3.5.7. Phương pháp nghiên cứu dịch tễ học
Phương pháp dịch tễ học mô tả: Được sử dụng để nghiên cứu các đặc điểm dương tính huyết thanh học theo các đặc điểm địa phương, giống loài, lứa tuổi, loại hình chuồng trại, quy mô.
Các mẫu được mã hóa kết hợp với thông tin được thu thập về các yếu tố như: địa phương, giống loài, loại hình chuồng trại, quy mô chăn nuôi, tình trạng sử dụng vacxin phòng vac xin aMPV, biểu hiện triệu chứng, bệnh tích.
3.5.8. Xử lý số liệu
Tỷ lệlưu hành của virus được tính toán các tiêu chí: lứa tuổi, loại hình chăn nuôi, địa điểm, v.v... Các bước tính toán và phân tích thống kê được thực hiện trên phần mềm Excel, Minitab 17, SPSS. Các phép tính thống kê được sử dụng là t-test, one-way ANOVA. Giá trị p < 0,05 được xác định là giới hạn sai khác có ý nghĩa thống kê.
PHẦN 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
Nghiên cứu này đã xác định sự lưu hành huyết thanh học và virus học của aMPV ở gà tại 10 tỉnh miền Bắc. Kết quảđược trình bày ở phần 4.1 và 4.2.
4.1. SỰLƯU HÀNH KHÁNG THỂ KHÁNG aMPV 4.1.1. Tỷ lệdương tính huyết thanh họctheo địa phương
Kết quảđịnh tính phản ứng ELISA gián tiếp phát hiện kháng thể đặc hiệu kháng aMPV ở 359 mẫu huyết thanh, từ 29 trang trại nuôi gà chưa từng sử dụng vacxin aMPV thuộc 10 tỉnh miền Bắc được minh họa ở hình 4.1.
Ghi chú: đối chứng âm (-), đối chứng dương (+)
Ở giếng đối chứng âm chuẩn không thấy xuất hiện màu, trong khi đó giếng đối chứng dương hiện màu vàng đậm (hình 4.1). Dựa vào màu, các mẫu có màu được xác định là có kháng thể kháng aMPV. Thống kê tỷ lệ mẫu dương tính huyết thanh học với aMPV theo địa phương và trang trại được trình bày ở bảng 4.1 và hình 4.2.
Bảng 4.1. Kết quảxác định dương tính huyết thanh học theo số mẫu và theo trại ởcác địa phương
Địa phương
Theo mẫu xét nghiệm Theo trang trại có mẫu xét nghiệm Số mẫu kiểm tra Số mẫu dương tính Tỷ lệ (%) Số trại lấy mẫu Số trại dương tính Tỷ lệ (%) Bắc Ninh 53 33 62,3% 5 5 100,0% Hà Nam 39 38 97,4% 3 3 100,0% Hà Nội 46 6 13,0% 3 1 33,3% Hải Phòng 15 0 0,0% 1 0 0,0% Hòa Bình 30 12 40,0% 2 2 100,0% Phú Thọ 34 2 5,9% 3 2 66,7% Quảng Ninh 45 4 8,9% 4 2 50,0% Thái Bình 11 0 0,0% 1 0 0,0% Thái Nguyên 64 14 21,9% 5 5 100,0% Yên Bái 22 21 95,5% 2 2 100,0% Tổng hợp 359 130 36,2% 29 22 75,9%
Kết quả bảng 4.1, xác định được 130/359 mẫu huyết thanh gà có kháng thể kháng aMPV, tương đương tỷ lệ dương tính trung bình của các cá thể trong các đàn khảo sát là 36,2%. Đã xác định được 22 trang trại trong tổng 29 trang trại khảo sát với ít nhất một mẫu huyết thanh dương tính (giá trị S/P ≥ 0,2) với kháng thể kháng aMPV. Tỷ lệnày tương đương với 75,9 % các đàn gà (chưa từng được phòng vacxin aMPV) dương tính tự nhiên với kháng thể kháng aMPV.
Hình 4.2. Tỷ lệdương tính kháng thể kháng aMPV theo địa điểm
Mức độlưu hành huyết thanh học trong đàn gà ghi nhận ở đây không cao so với tỷ lệdương tính huyết thanh học với kháng thể kháng aMPV là 53,29% ở gà nuôi tại Bangladesh (Ali & cs., 2019). Ngược lại, tỷ lệdương tính ở hình 4.2 khá tương đồng mức độlưu hành tại Jordan (Gharaibeh S. M. & Algharaibeh, 2007) và Ai Cập (Nagy & cs., 2018) ở tỷ lệxác định được 21,7%. Kết quả này thấp hơn rất nhiều với mức độ lưu hành trên các đàn gà có biểu hiện sưng phù đầu, quanh mắt, ức và cổ tại Đài Loan (86,4%) (Lu & cs., 1994). Điều này, có lẽ do các mẫu đã được lấy ngẫu nhiên từ các trang trại bao gồm cả có và không có tiền sử hay hiện tại liên quan tới hội chứng sưng phù đầu hoặc rối loạn hô hấp.
Kết quả trình bày tại hình 4.2A và hình 4.2B cho thấy giữa các địa phương cũng có sự khác biệt về tỷ lệ các mẫu và tỷ lệ trang trại có mẫu huyết thanh dương tính với kháng thể kháng aMPV. Trong đó, đáng chú ý các địa phương có tỷ lệdương tính huyết thanh học cao là Hà Nam với 97,4% mẫu huyết thanh, 100% số trang trại; Yên Bái với 95,5% mẫu huyết thanh và 100% trang trại có ít nhất một mẫu có kháng thể kháng aMPV, các tỷ lệ này ghi nhận tuy có
thấp hơn song vẫn ở mức độ từ trung bình tới cao tại Bắc Ninh với 62,3% và 100%; Hòa Bình là 40,0% và 100%; Bắc Ninh 38,1% và 100%; Thái Nguyên 21,9% và 100%. Ngược lại các vùng chăn nuôi khác như Hà Nội, Phú Thọ, Quảng Ninh có tỷ lệ dương tính thấp hơn chỉ ở mức 5,9%-13,0% song tỷ lệ trại dương tính lại khá cao và rất biến động (từ 33,3%- 66,7%).
Theo các số liệu thống kê (Tổng Cục Thống Kê, 2019) thì Hà Nội, Phú Thọ, Quảng Ninh, Bắc Ninh, Thái Nguyên, Hòa Bình là các địa phương quy mô/mật độ nuôi lớn tại khu vực miền Bắc, song tỷ lệ dương tính huyết thanh học kháng thể kháng aMPV lại rất thấp. Điều này có thể do giới hạn của khảo sát, các mẫu thu thập chỉ được thực hiện tại các đàn gà chưa sử dụng vacxin aMPV. Theo điều tra trước khi thực hiện lấy mẫu, trong khoảng thời gian từ cuối năm 2017 đến nay, tại các vùng này đã và đang áp dụng vacxin phòng aMPV cho các đàn gà. Do đó việc lựa chọn trang trại đủ điều kiện chưa chủng với vacxin aMPV để lấy mẫu là rất khó nên số lượng mẫu thu thập được khá thấp ở tại các khu vực này. Vì thế, mức độ dương tính huyết thanh học với aMPV ở các trang trại chăn nuôi thuộc các tỉnh thành này chưa phản ánh đúng tình trạng dương tính.
Cho đến nay, nhiều mầm bệnh hô hấp ởgà được khẳng định có mặt tại Việt Nam (Hảo, 2008; Trương Hà Thái & cs., 2009; Nguyễn Bá Tiếp & cs., 2016; Nguyễn Thị Lan & cs., 2016; Nguyễn Thị Loan & cs., 2017). Kết quả khẳng định sự có mặt của aMPV của nghiên cứu này càng cho thấy tính chất phức tạp của nhóm bệnh hô hấp xảy ra ở gà tại nước ta.
4.1.2. Tỷ lệdương tính huyết thanh học theo giống gà
Các nghiên cứu trước đây về sự lưu hành huyết thanh học của aMPV chủ yếu tập trung vào liên quan tới gà tây (Toro & cs., 1998), gà trắng thương phẩm, gà đẻ siêu trứng thương phẩm và gà bố mẹ (Chettle & Wyeth, 1988; Baxter‐Jones & cs., 1989; Eterradossi & cs., 1995; Chiang & cs., 2000; Alkahalaf & cs., 2002). Theo Aung Ye Htut (2007) cho đến nay, rất ít nghiên cứu về tỷ lệ lưu hành huyết thanh học ở các đàn gà nhà, mà đặc biệt là các nhóm gia cầm bản địa lai với các giống cao sản ngoại nhập. Vì vậy, nghiên cứu đã thực hiện xác định tỷ lệ lưu hành huyết thanh học của aMPV trên các giống gà nuôi phổ biến tại tại các trang trại miền Bắc hiện nay. Kết quả được trình bày trong bảng 4.2.
Bảng 4.2. Tỷ lệ dương tính huyết thanh học theo giống gà Nhóm gà Giống gà Số mẫu kiểm tra Tỷ lệ dương tính (%) Trung bình (%) Siêu thịt Ross 308 49 8,2 8,2 Bản địa lai Gà Ai Cập trắng lai 21 0,0 35,0 Gà J Hòa Phát 14 100,0 Gà J Dabaco 28 71,4 Gà J Japfa 11 18,2 Gà J Mavin 9 11,1 Gà lai chọi 66 19,7 Gà Tiến Đạt 10 20,0
Gà Mía x Lương Phượng 12 0,0
Gà Thanh Lương 12 100,0 Bản địa Gà Minh Dư 10 100,0 48,8 Gà Ri 11 36,2 Gà Hồ 90 42,2 Gà Lạc Thủy 16 62,5 Tổng hợp 359 36,2
Kết quả bảng 4.2 cho thấy mức độ dương tính huyết thanh học với aMPV giữa các giống gà thì có sự khác biệt. Đáng chú ý ở đây là tỷ lệ cao nhất các gà thuộc nhóm gà bản địa của nước ta bao gồm gà Minh Dư (gà bản địa Bình Định) dương tính 100,0%, Lạc Thủy (gà bản địa vùng Lạc Thủy Hòa Bình) 62,5% sau đó đến gà Hồ (42,2%), gà Ri bản địa (36,2%). Trong khi đó tỷ lệ này rất biến động ở nhóm gà lai (giữa một giống bản địa và một giống ngoại nhập). Cụ thể, tỷ lệdương tính cao nhất ghi nhận ở gà J Hòa Phát và gà Thanh Lương với 100% số mẫu phát hiện dương tính kháng thể, tiếp theo là gà J Dabaco 71,4%, thấp hơn ở gà Tiến Đạt (con gà Chọi lai Lương phượng) (20,0%), Lai Chọi (19,7%), J Japfa (18,2%), J Mavin (11,1%). Gà trắng siêu thịt Ross 308 xác định được tỷ lệ mẫu huyết thanh dương tính với kháng thể kháng aMPV chỉở mức 8,2%. Không phát hiện được mẫu dương tính huyết thanh học được ghi nhận là ở các gà Ai Cập lai, và gà Mía lai Lương Phượng.
Kết quả trình bày trong bảng 4.2 cho thấy nhóm gà bản địa có mức độ lưu hành huyết thanh ở mức 48,8% cao hơn khoảng 13,8% so với tỷ lệ35,0% dương tính ởnhóm gà lai. Đặc biệt tỷ lệdương tính ở gà trắng siêu thịt lại rất thấp 8,2%.
Tỷ lệ dương tính ở nhóm gà lai khá tương đồng với các khảo sát huyết thanh học thực hiện trước đây trên các đàn gà thịt giống bản địa và bản địa lai như: giống gà lai Sonali (con lai giữa gà trống Rhode Island Red x gà mái bản địa Fayoumi) tại Bangladesh ghi nhận được 35,57% dương tính huyết thanh học kháng aMPV (Ali & cs., 2019). Song tỷ lệdương tính thu được chiếm đến gần ½ số mẫu ở nhóm gà bản địa (48,8%) lại chưa phù hợp do thấp hơn nhiều so với tỷ lệ dương tính ở giống gà bản địa (Hanhyup-3) của Hàn Quốc với 78,2%. Điều này tương tự ở các kết quảdương tính huyết thanh học (8,2%) từ các mẫu thu được từ gà trắng siêu thịt với tỷ lệxác định được trong khảo sát cũng rất thấp so với mức dương tính lần lượt tại Hàn Quốc là 60,1% và 79,2% ở gà siêu thịt trắng Cobb, Ross (Lee & cs., 2006).
Mặc dầu so sánh ở trên tỷ lệ dương tính huyết thanh học thấp hơn so với các nghiên cứu đã thực hiện, song lại thống nhất vềđặc điểm mức độ dương tính ở các gà bản địa thường cao hơn các kết quả của ghi nhận được trên giống gà trắng siêu thịt, gà lai. Các kết quả trên là hoàn toàn phù hợp kết luận được rút ra từ nghiên cứu trước đây là: mức độ dương tính và hiệu giá kháng thể ở gà thịt thường thấp hơn gà đẻ, hoặc gà đẻ giống (Pattison & cs., 1989; Minta & cs., 1995). Các kết quả và phân tích trên có thể thấy rằng ở những giống gà bản địa có tỷ lệ dương tính cao hơn so với các giống gà lai, và các giống nhập nội. Do