3.1. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
- Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ sinh học Thú y, khoa Thú y, Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam.
3.2. THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
- Từ tháng 6 năm 2019 đến tháng 5 năm 2020.
3.3. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
- Lợn mắc bệnh Dịch tả lợn Châu Phi (Lợn lai 2 máu, 3 máu).
3.4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Thu thập mẫu bệnh phẩm, sàng lọc và xác định một số triệu trứng lâm sàng của lợn mắc bệnh DTLCP
- Nghiên cứu bệnh tích đại thể và vi thể chủ yếu của lợn mắc bệnh DTLCP - Nghiên cứu sự phân bố kháng nguyên virus Dịch tả lợn Châu Phi bằng kỹ thuật hóa mô miễn dịch
3.5. NGUYÊN LIỆU NGHIÊN CỨU
Máy móc, thiết bị được sử dụng trong đề tài: máy đúc mẫu tựđộng Microm (STP120, Fisher Scientific, Mỹ), máy cắt tiêu bản Microm (HM 315, Fisher Scientific, Mỹ), phiến nhiệt làm khô tiêu bản (Fisher Scientific, Mỹ), nồi hấp ướt ( ALP, Nhật), kính hiển vi quang học (Nikon Eclipse E100, Nhật), bộ nhuộm tiêu bản, casette block, phiến kính cho hóa mô miễn dịch, lamen, pipet và đầu tip các loại, ống eppendorf 1,5ml, găng tay, khẩu trang, kháng thể sơ cấp kháng virus DTLCP (ASFV11-S, Anpha Diagnostic international, Mỹ), kháng thể thứ cấp ( Histofine MAX-PO Multi, Nichirei Bioscience, Nhật), Cồn tuyệt đối (Merk); Parafin tinh khiết (Thermofisher, Mỹ), PBS (photphat buffer saline, Life technology, Mỹ), xylen (Trung Quốc), methanol tinh khiết (Trung Quốc), DAB (3,3’diaminobenzidine, sigma, Đức), H2O2 30%, thuốc nhuộm HE&Eosin, baume canada. Box an toàn sinh học Cấp II (Esco), máy Realtime PCR (Biorad), máy tách chiết DNA/RNA tự động (Thermo Scientific), máy votex (IKa), máy ly tâm (eppendorf), tủ -800C (Sanyo).
Dụng cụ: Pipet (Eppendorf), đầu típ các loại (Corning), ống eppendorf, bơm tiêm, găng tay, khẩu trang. Các hóa chất vật liệu cần thiết khác.
3.6. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.6.1. Phương pháp quan sát, mô tả
- Quan sát, mô tả là phương pháp đầu tiên, đơn giản nhưng rất có hiệu quả trong việc chẩn đoán bệnh.
Trạng thái bình thường của lợn không mắc bệnh: con vật nhanh nhẹn, tỉnh táo; đi đứng, ăn uống bình thường; màu sắc da hồng, lông bình thường; niêm mạc không bị tổn thương,…
Trạng thái khi lợn mắc bệnh: mệt mỏi, ủ rũ, thân nhiệt tăng, bỏăn hoặc kém ăn; màu sắc da thay đổi, không đều màu, xuất huyết ngoài da ở vùng tai, hông hoặc hậu môn; rối loạn hô hấp, hôn mê.
3.6.2. Phương pháp mổ khám
Phương pháp này dùng để nghiên cứu biến đổi bệnh tíchđại thể của con bệnh Chuẩn bị hóa chất và các thiết bị dụng cụ mổ khám
Hóa chất: Cồn 75o, Cloramin,…
Dao mổ, kéo mổ, lưỡi dao; panh gắp kẹp, panh kẹp giống kéo; cưa; ống lưu mẫu túi zip; găng tay, khẩu trang. Các dụng cụ mổ khám phải được vô trùng sạch sẽ.
Làm chết con vật
Nếu con vật còn sống phải thực hiện các biện pháp làm chết con vật trước khi thực hiện các thao tác mổ khám, tránh gây biến đổi lớn về mức độ quan sát bệnh tích, tháo tiết để làm chết con vật.
Tiến hành mổ khám
Kiểm tra bên ngoài: Thể trạng, da, lông, vết thương, các khối u, mụn nước, vết loét, các lỗ tự nhiên, các khớp, ngoại ký sinh trùng vv...
Mổ khám kiểm tra bên trong.
• Đặt lợn nằm trên tấm trải 3 lớp, dùng dao cắt các cơ trong nách tới khớp xương bả vai, cắt các cơ trong bẹn tới khớp hông ở cả hai bên chân. Bẻ gập chân sang hai bên cho lợn nằm ngửa trên tấm trải.
• Dùng dao cắt lớp da và cơ từ cằm kéo dài tới cửa vào lồng ngực, cắt tiếp lớp sụn xương ức ở hai bên lật xương ức, kéo dài tới cơ hai bên thành bụng để bộc lộ toàn bộ các tổ chức vùng cổ, xoang ngực, xoang bụng.
• Quan sát những biến đổi bên ngoài các tổ chức về màu sắc, kích thước, hình dáng .v.v...
• Dùng dao cắt các cơ hai bên cằm giữlưỡi, kéo lưỡi ra khỏi xoang miệng, kiểm tra xoang miệng.
• Cắt các tổ chức giữ lưỡi, thực quản, khí quản, phổi, cuối cùng cắt đứt thực quản, mạch quản giáp với cơ hoành, lấy các tổ chức trong cổ, ngực, rửa trong nước để kiểm tra chi tiết bên ngoài.
Kiểm tra màng, dịch xoang bao tim; kiểm tra cơ, van, chân cầu bên trong tim. Kiểm tra hạch Amidan, thanh quản, khí quản, phế quản, phế nang phổi. Kiểm tra thực quản. Lấy gan, mật, lá lách ra để kiểm tra về màu sắc, kích thước, độ cứng mềm, ký sinh trùng .v.v...
Kiểm tra tuyến tuỵ. Cắt đứt da, cơ dọc theo khớp bán động háng, dùng mũi dao tách rời khớp bán động háng, bộc lộ xoang chậu.
Loại bỏ màng treo ruột, kéo dạ dày, ruột non, ruột già tới tận hậu môn để ra ngoài kiểm tra sau cùng, tránh nhiễm bẩn dụng cụ và các tổ chức khác.
Kiểm tra toàn bộcơ quan sinh dục (buồng trứng, ống dẫn trứng đối với con cái; dịch hoàn, ống dẫn tinh với con đực) cả bên ngoài và bên trong.
Kiểm tra bên ngoài thận, ống dẫn niệu, bóng đái, tiếp tục mổ kiểm tra bên trong. Kiểm tra hệ thống hạch trong cơ thể. Kiểm tra hệ thống tiêu hoá theo thứ tự từ dạ dày tới hậu môn đặc biệt chú ý tới vùng van hồi manh tràng về các chất chứa, dịch, màu sắc, điểm hoại tử, xuất huyết .v.v...
Cắt kiểm tra dịch, màu sắc các khớp xương, cưađể kiểm tra tuỷxương bên trong. Tách não ra để kiểm tra
Trong quá trình mổ khám cần ghi chép lại các thông tin, chụp ảnh. Sau khi mổ khám cần vệ sinh sát trùng nơi mổ khám, xử lý rác thải và cần có biên bản mổ khám.
3.6.3. Phương pháp lấy mẫu và xử lý mẫu
Lấy mẫu
Mẫu dùng để chẩn đoán bệnh DTLCP: máu chống đông, phổi, lách, hạch, thận, dạ dày, ruột, tử cung, dịch Swab của những lợn ốm nghi bệnh.
Mẫu được bảo quản trong túi nilon hoặc ống lưu mẫu đã được vô trùng, được bảo quản ở điều kiện 2 – 8oC, mẫu phải được xử lý trong vòng 24 giờ. Nếu chưa xử lý ngay, cần lưu mẫu ở nhiệt độ -20oC đến -80oC.
Xử lý mẫu
Đối với mẫu máu cần ly tâm chắt lấy huyết thanh.
Mẫu dịch Swab cho vào ống fancol cùng với PBS rồi votex sau đó thu dịch nổi.
Mẫu bệnh phẩm lấy một lượng nhỏ khoảng 100µg bệnh phẩm, nghiền tổ chức bằng máy công phá mẫu (1.000 vòng/5 phút), sau đó thêm 450µl PBS vào mẫu đã nghiền, ly tâm 1500g trong 10 phút. Thu dịch nổi có thể dùng để chẩn đoán phát hiện virus DTLCP bằng phản ứng Realtime PCR.
3.6.4. Phương pháp Realtime PCR
+ Tách chiết DNA.
DNA được tách chiết bằng kit TacoTM DNA/RNA Extraction Kit để tiến hành phản ứng Realtime PCR.
Các bước tách chiết DNA được thực hiện theo hướng dẫn đi kèm của nhà sản xuất gồm:
• Thêm thuốc thử vào đĩa ly trích 96 giếng/48 giếng theo bảng dưới đây ở nhiệt độ phòng (16 – 30oC).
Bảng 3.1. Thuốc thử
Bước Thuốc thử
1 Thêm 200µl cồn 95% và 500µl dung dịch đệm giải vào cột 1 (cột 7)
2 Thêm 750µl dung dịch đệm rửa A1vào cột 2 (cột 8)
3 Thêm 750µl dung dịch đệm rửa A vào cột 3 (cột 9)
4 Thêm 750µl dung dịch đệm rửa B2vào cột 4 (cột 10)
5 Thêm 750µl dung dịch đệm rửa B vào cột 5 (cột 11)
6 Thêm 50 – 200µl dung dịch đệm rửa giải vào cột 6 (cột 12)
7 Thêm 50µl hạttừ tính (3)vào cột 2 (cột 8)
1 Đảm bảo rằng 135 ml cồn 95% đã được thêm vào dung dịch đệm rửa A trước khi sử dụng lần đầu tiên.
2 Đảm bảo rằng 230 ml cồn 95% đã được thêm vào dung dịch đệm rửa B trước khi sử dụng lần đầu tiên.
• Hút 200µl dung dịch mẫu đồng nhất vào cột 1 (cột 7) của đĩa ly trích 96 giếng/48 giếng. Mở cửa máy TacoTM để lắp đĩa ly trích và lược vào, đảm bảo rằng chúng được đặt vào đúng vị trí.
• Đóng cửa máy TacoTM và nhấn nút “Start” để bắt đầu tách chiết. Máy sẽ tách xong sau 50 phút. Sau khi tách chiết xong, lấy đĩa ly trích và lược ra, sau đó nhấn nút “Reset” để thiết lập lại chương trình.
• Thu acid Nucleic từ cột 6 hoặc cột 12, cho vào ống 1,5 ml mới để sử dụng.
• Acid Nucleic tách chiết nên được bảo quản lạnh, nếu để lưu trữ lâu dài thì nên bảo quản ở -80oC.
3 Than hoạt tính phải được giữa kín trước khi sử dụng
Huyễn dịch bệnh phẩm sau khi được thực hiện tách chiết DNA bằng các kít thương mại và bảo quản mẫu DNA ở 40C nếu xét nghiệm ngay, hoặc bảo quản - 200C trong thời gian dài.
Chuẩn bị mồi
Phản ứng Realtime PCRsử dụng cặp mồi xuôi, mồi ngược và đoạn dò được thiết kế dựa trên vùng ổn định của gen P72 như sau:
Bảng 3.2. Trình tự mồi – mẫu dò
Stt Tên Trình tự (5’ – 3’)
1 Mồi xuôi ASFV gATgATgATTACCTTYGCTTTGAA (0,9µM)
2 Đoạn dò ASFV CCACGGGAGGAATACCAACCCAGTG (0,3µM)
3 Mồi ngược ASFV TCTCTTGCTCTRGATACRTTAATATGA (0,9µM)
Tiến hành phản ứng Realtime PCR
Sử dụng cặp mồi đã chuẩn bị và bộ kít thương mại, pha hỗn hợp phản ứng (Master mix) và cài đặt chu trình nhiệt theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Phòng thí nghiệm sử dụng kit để chẩn đoán là: invitrogen – Super scrip iiI®platium one – Step qRT – PCR System.
Thành phần Master mix như trong bảng 3.3.
Sau khi chuẩn bị xong nguyên liệu master mix tiến hành:
• Thêm 2µl DNa của mẫu vừa tách chiết vào ống và spin down.
• Đối với ống đối chứng dương và âm cũng cho tương tự 13µl hỗn hợp Master mix vào ống Real – time PCR 0,2ml. Sau đó thêm:
• Thêm 2µl Dna dương chuẩn của virus DTLCP có giá trị Ct đã biết trước vào ống đối chứng dương.
• Cho 2µl nước tinh khiết không có Rna và DnA vào ống đối chứng âm. Chú ý: Phản ứng Realtime PCR phải bao gồm: mẫu kiểm tra, mẫu đối chứng dương (Postive – POS) và mẫu đối chứng âm (negative – nEg).
Bảng 3.3. Thành phần phản ứng Realtime PCR STT Thành phần nguyên liệu nồng độ sử dụng STT Thành phần nguyên liệu nồng độ sử dụng (µM) Thế tích cho 1 phản ứng (µl) 1 DW 4,3 2 2x Reaction buffer 7,5 3 Mồi xuôi ASFV 40 0,3
4 Mồi ngược ASFV 40 0,3
5 Đầu dò ASFV 10 0,3
6 Enzym mix 0,3
Tổng thể tích dung dịch đệm cho 1 phản ứng 13 7 Mẫu tách chiết DNA 2 Tổng thể tích cho 1 phản ứng 15
Cài đặt chu kỳ luân nhiệt và chạy phản ứng Realtime – PCR
Sau khi Master mix, đặt ống vào máy Realtime PCR để chạy phản ứng theo chu kỳ luân nhiệt sau:
Bảng 3.4. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng Realtime PCR
Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ
95oC 2 phút 01
95oC 15 giây 45
60oC 45 giây
(ghi nhận tín hiệu huỳnh quang) 45 Đọc kết quả phản ứng Realtime PCR
Kết quả của phản ứng Realtime PCR được xác định dựa vào chu kỳngưỡng (Cycle threshold: Ct).
Phản ứng được công nhận khi mẫu đối chứng dương tính (được chẩn độ trước) phải có giá trị Ct tương đương giá trị Ct đã biết (± 2Ct), mẫu đối chứng âm không có Ct.
Với điều kiện phản ứng:
• Mẫu dương tính khi giá trịCt ≤ 35;
• Mẫu ấm tính khi không có giá trị Ct;
• Mẫu nghi ngờ khi giá trị Ct >35.
Đánh giá kết quả: mẫu có virus DTLCP khi kết quả Realtime PCR dương tính. Với những mẫu nghi ngờ cần được thực hiện lại xét nghiệm hoặc sử dụng phương pháp xét nghiệm khác để khẳng định kết quả.
3.6.5. Phương pháp RT-PCR
3.6.5.1. Phương pháp tách chiết DNA/RNA tổng số
Tách chiết DNA/RNA tổng số từ mẫu bệnh phẩm sử dụng Kit chiết tách thương mại. Các bước tách chiết DNA/RNA được thực hiện theo hướng dẫn đi kèm của nhà sản xuất gồm:
1. Lấy 560 µl dung dịch AVL có chứa carrier RNA cho vào ống ly tâm 1.5 ml;
2.Thêm 140 µl mẫu (huyết tương, huyết thanh, dịch nuôi cấy tế bào, dịch swab) vào ống ly tâm trên. Trộn đều bằng máy voltex;
3.Ủở nhiệt độ 15-200C trong 10 phút;
4.Ly tâm để cho các phần dung dịch trên nắp rơi xuống hết ống nghiệm; 5.Thêm 560 µl ethanol (96-100%) vào mẫu, trộn đều bằng máy voltex trong 15giây. Sau đó, spindown toàn bộ dung dịch xuống;
6.Cẩn thận lấy 630 µl dung dịch ở bước 5 cho vào ống Qiaamp Mini (dung tích 2ml). Đậy nắp, ly tâm tốc độ 8000 vòng/phút/1 phút, loại bỏ phần dịch phía dưới;
7.Lặp lại bước 6;
8.Cho 500µl buffer AW1. Đậy nắp, ly tâm tốc độ 8000 vòng/phút/1 phút. Loại bỏ dịch dưới ống;
10. Ly tâm tốc độ 1400 vòng/phút/ 3 phút. Thu được 60 µl dịch chiết ARN tổng số;
11. Bảo quản mẫu RNA ở nhiệt độ -200C.
3.6.5.2. Phương pháp RT- PCR
Các bước tiến hành phản ứng RT – PCR: Mẫu RNA tổng số sau khi tách chiết sẽđược trộn với các thành phần phản ứng được trình bày ở bảng 3.5.
Bảng 3.5. Thành phần phản ứng RT-PCR Thành phần phản ứng Thể tích cần lấy (µl) Thành phần phản ứng Thể tích cần lấy (µl) 2X Reaction Mix 12,5 Mẫu RNA 5,0 Mồi xuôi (10µM) 0,5 Mồi ngược (10µM) 0,5 RT/Platium Taq 0,5 Nước cất 6,0 Tổng số 25,0
Tiến hành phản ứng khuếch đại sản phẩm trong máy PCR theo chu kỳ nhiệt với cặp mồi:
PRRSVF: 5’-TCC TAC Tgg CAA TTT GAA TG-3’; PRRSVR: 5’-CCT TTA GAG CAT ATA TCA TCA C-3’; CSF4F: 5’-CCT GAG GAC CAA ACA CAT GTT G-3’; CSF5R: 5’-TGG TGG AAG TTG GTT GTG TCT G-3’.
Chu kỳ của phản ứng nhiệt RT-PCR cho PRRSV
Giai đoạn Bước tổng hợp Nhiệt độ (oC) Thời gian Chu kỳ
1 Tổng hợp cDNA 45 45 phút 1 Duỗi mạch 95 2 phút 2 Duỗi mạch 95 30 giây 35 Gắn mồi 50 30 giây Tổng hợp sợi mới 72 1 phút 3 hoàn chỉnh 72 10 phút 1 4 Giữ sản phẩm 4
Chu kỳ của phản ứng nhiệt RT-PCR cho CSFV
Giai đoạn Bước tổng hợp Nhiệt độ (oC) Thời gian Chu kỳ
1 Tổng hợp cDNA 45 45 phút 1 Duỗi mạch 95 2 phút 2 Duỗi mạch 95 30 giây 35 Gắn mồi 43 1 phút Tổng hợp sợi mới 72 1 phút 3 hoàn chỉnh 72 10 phút 1 4 Giữ sản phẩm 4
Chuẩn bị dung dịch đệm và bản gel
Dung dịch đệm thường được sử dụng trong điện di agarose và polyacrylamid là TBE, trong nghiên cứu này sử dụng TBE và agarose để tạo bản gel.
Chuẩn bị gel: hòa tan 1,2 gam agarose với 100ml dung dịch đệm TBE 1X, đun nóng ở 1000C/5 phút. Sau đó đổ vào khuôn có lược được cài sẵn để tạo bản gel với các giếng tra mẫu điện di. Khi bản gel đã đông cứng đặt bản gel vào bể điện di và bổ sung dung dịch đệm TBE ngập bản gel khoảng 3 – 5 mm.
• Bước 2: Tra mẫu điện di
Thêm 2 µl loading dye vào 8 µl sản phẩm RT- PCR, trộn đều hỗn dịch bằng pipet và chuyển vào các giếng trong bản thạch. Điện di đồng thời cả thang chuẩn DNA (marker), thường sử dụng 4-6 µl DNA Marker.
• Bước 3: Chạy điện di
Nguồn điện trong điện di thường sử dụng ở hiệu điện thế 100V cường độ 100mA, thời gian chạy điện di trong 30 phút.
• Bước 4: Nhuộm bản gel và đọc kết quả
Kết thúc điện di, bản gel được chuyển vào máy phát tia UV để quan sát kết quảđiện di. Vị trí các đoạn DNA được phát hiện bằng những vệt sáng tương ứng của thuốc nhuộm, chụp ảnh và lưu kết quả.
3.6.6. Phương pháp PCR
3.6.6.1 Tiến hành chạy PCR
Mẫu DNA sau khi tách chiết sẽ được hỗn hợp với các thành phần được trình bày ở bảng 3.6.
Bảng 3.6. Thành phần phản ứng PCR Thành phần phản ứng Thể tích cần lấy (μl) Thành phần phản ứng Thể tích cần lấy (μl) Go taq Green 12.5 Mẫu DNA 5 Mồi xuôi 0.5 Mồi ngược 0.5
Nước khử ion (DEPC – treated) 6
Tổng thể tích 25
Cặp mồi được sử dụng trong phản ứng PCR phát hiện PCV2:
Stt Tác nhân
gây bệnh Tên mồi Trình tự mồi
1 Virus Circo PCV2F 5’- GAA GAA TGG AAG AAG CGG -3’ 2 PCV2R 5’ - GTC ACA GCA GTA GAC AGG T-3
Chu kỳ của phản ứng nhiệt PCR cho phản ứng PCR phát hiện PCV2
Giai đoạn Bước tổng hợp Nhiệt độ (oC) Thời gian Chu kỳ