L ời cảm ơn
4.3.1. Kết quả phát hiện kháng nguyên virus Dịch tả lợn Châu Phi bằng kỹ thuật
thuật hóa mô miễn dịch
Từ 30 ca bệnh lợn dương tính với virus DTLCP, lựa chọn ra 5 ca bệnh điển hình đại diện cho các tỉnh thành nghiên cứu (thành phố Hà Nội, tỉnh Hà Nam, Hưng Yên, Nam Định và Thái Bình), áp dụng kỹ thuật nhuộm hóa mô miễn dịch để xác định sự có mặt kháng nguyên virus tại các tổ chức. Phát hiện sự có mặt của virus trong tổ chức đem nhuộm hóa miễn dịch sẽ cho kết quả dương tính khi xuất hiện màu nâu vàng trên lát cắt tổ chức (màu của DAB). Như vậy, dựa vào sự xuất hiện màu nâu vàng tại các tế bào tổ chức của tiêu bản có thểđánh giá được vị trí virus cư trú và mật độ virus phân bố tại đó.
Mỗi ca bệnh sẽ lấy ra mẫu lách, hạch, phổi, gan, thận, não, tim, dạ dày, ruột tiến hành nhuộm hóa mô miễn dịch. Kết quả sự phân bố kháng nguyên virus DTLCP tại các cơ quan nội tạng được trình bày trong bảng 4.7.
Bảng 4.7. Kết quả phát hiện kháng nguyên virus DTLCP tại các mô lợn mắc bệnh bằng kỹ thuật hóa mô miễn dịch
TT Cơ quan Kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch
Con 1 Con 2 Con 3 Con 4 Con 5
1 Hạch +++ +++ +++ +++ +++ 2 Lách +++ ++ ++ +++ +++ 3 Phổi +++ ++ ++ ++ +++ 4 Thận ++ ++ ++ ++ ++ 5 Gan ++ ++ ++ + ++ 6 Não - ++ + - + 7 Tim - + - + + 8 Ruột + - + - - 9 Dạ dày + - - + +
Ghi chú: (-)Không có tế bào dương tính/1 tiêubản
(+): có dưới 10 tế bào dương tính/1 tiêu bản
(++): có từ 11-50 tế bào dương tính/1 tiêu bản
Kết quả bảng 4.7 cho thấy cả 9 tổ chức nghiên cứu đều dương tính với virus DTLCP thể hiện bằng sự xuất hiện của các đám màu nâu vàng trên tiêu bản, tuy nhiên sự phân bố kháng nguyên virus lại khác nhau trên các cơ quan tổ chức. Trong đó hạch và lách là cơ quan có sự phân bố kháng nguyên virus nhiều nhất thể hiện bằng sự xuất hiện các đám màu vàng nâu với mật độ cao và lan tràn khắp tiêu bản, tiếp theo là phổi, gan và thận kháng nguyên virus phân bố ít hơn hạch và lách. Các mô não, tim, ruột và dạ dày tùy từng ca bệnh có thể phát hiện hay không phát hiện được kháng nguyên virus. Quan sát trên các tiêu bản nhuộm hóa mô miễn dịch thấy:
Trong hạch lympho phát hiện các tế bào đơn nhân dương tính với kháng nguyên virus DTLCP có rất nhiều (hình 4.7b). Trong phổi, đại thực bào phổi được tìm thấy dương tính với kháng nguyên virus DTLCP (hình 4.7a). Trong não xác định kháng nguyên virus DTLCP trong các tế bào đại thực bào não (hình 4.7d). Trong mô thận, nhiều tế bào dương tính với kháng nguyên virus DTLCP trong đó có tế bào biểu mô ống thận (hình 4.7f). Đôi khi, một vài tế bào dương tính được tìm thấy trong mạch quản của cầu thận được xác định là đại thực bào. Ở gan, các tế bào dương tính với kháng nguyên virus DTLCP đã được tìm thấy trong các tế bào gan và tế bào Kuffer (hình 4.7c hình 4.9a). Fernandez và cs., 1992 đã phát hiện kháng nguyên virus ở bạch cầu đơn nhân, đại thực bào, tế bào gan, tế bào nội mô, bạch cầu trung tính trong khi đó Gomez và cs., 1995 cho rằng virus nhân lên trong tế bào thực bào đơn nhân lớn, đại thực bào và đi khắp cơ thể thông qua mạch máu và hệ bạch huyết. Virus cũng có thể nhân lên ở tế bào nội mô, tế bào gan, tế bào biểu mô, ống thận. Các kết quả nghiên cứu phát hiện kháng nguyên virus DTLCP của chúng tôi là hoàn toàn tương đồng với Gomez và cs., 1995 và Fernandez và cs., 1992. Nghiên cứu này cũng không phát hiện được kháng nguyên virus ở các tế bào lympho. Minguez và cs., 1988 cũng đã báo cáo virus không nhiễm vào tế bào lympho B và T.
Hình 4.7. Hình ảnh các tếbào dương tính với kháng nguyên virus DTLCP (IHC400X)
Kháng nguyên virus DTLCP được phát hiện trong các tế bào đại thực bào mô phổi và não (hình a và d), tế bào đơn nhân mô hạch và lách (hình b và e), tế bào gan và tế bào biểu mô ống thận (hình c và f)
Hình 4.8. Đánh giá mức độ phân bố kháng nguyên virus DTLCP trên mẫu mô dương tính (IHC40X)
“+”: ít, có 1-10 tế bào dương tính/tiêu bản (hình c, f) “++”: trung bình, có 11-50 tế bào dương tính/tiêu bản (hình b,e), “+++”: nhiều, có trên 50 tế bào dương tính/tiêu bản (hình a,d)
Hình 4.9. Hình ảnh tếbào đại thực bào dương tính với kháng nguyên virus DTLCP ở một sốcơ quan (IHC40X)
Kháng nguyên virus DTLCP được phát hiện trong các đại thực bào ở một số cơ quan a, gan; b, thận; c, tim; d, ruột; e, dạ dày; f, tử cung
4.3.2. So sánh sự phân bố kháng nguyên virus DTLCP bằng phương pháp
Hóa mô miễn dịch và phương pháp Realtime PCR
Để đánh giá tương quan sự phân bố kháng nguyên virus DTLCP và kết quả phát hiện virus DTLCP bằng phương pháp Realtime PCR, từ các mẫu mô của 5 ca bệnh dương tính với virus Dịch tả lợn Châu Phi (mỗi loại mẫu mô được lấy riêng rẽ ngay từ khi thu mẫu và lựa chọn vùng tổn thương đặc trưng, mẫu được nghiền trong máy đồng nhất mẫu) 100 mg mẫu được đưa vào tách chiết DNA và xác định lượng virus DTLCP bằng phương pháp Realtime PCR. Thông qua giá trị Ct có thểxác định hàm lượng virus ở các cơ quan khác nhau. Giá trị Ct càng thấp thể hiện hàm lượng virus càng cao. Kết quả so sánh tương quan phân bố kháng nguyên virus DTLCP bằng kỹ thuật hóa mô miễn dịch và Realtime PCR được thể hiện tại bảng 4.8
Bảng 4.8. Kết quả so sánh tương quan phân bố kháng nguyên virus DTLCP
bằng kỹ thuật hóa mô miễn dịch và Realtime PCR
TT Cơ
quan
Con 1 Con 2 Con 3 Con 4 Con 5
IHC Ct IHC Ct IHC Ct IHC Ct IHC Ct
1 Hạch +++ 17,29 +++ 19,12 +++ 19,58 +++ 16,28 +++ 18,46 2 Lách +++ 16,62 ++ 20,06 ++ 20,00 +++ 15,43 +++ 17,23 3 Phổi +++ 18,43 ++ 20,24 ++ 22,13 ++ 20,81 +++ 19,12 4 Thận ++ 21,08 ++ 24,07 ++ 24,44 ++ 23,81 ++ 20,37 5 Gan ++ 20,66 ++ 22,93 ++ 22,08 + 25,09 ++ 24,30 6 Não - 24,27 ++ 25,37 + 28,63 - 29,78 + 26,42 7 Tim - 27,72 + 28,60 - 27,00 + 30,15 + 28,13 8 Ruột + 25,38 - 27,50 + 26,38 - 29,19 - 25,19 9 Dạ dày + 35,84 - 38,45 - NA - NA + 37,63
Ghi chú: Ct (cycle threshold-chu kỳ ngưỡng) Ct ≤ 40 là dương tính. NA: âm tính (-) Không có tế bào dương tính/1 tiêu bản; (+): có dưới 10 tế bào dương tính/1 tiêu bản; (++): có từ 11-
50 tế bào dương tính/1 tiêu bản; (+++): có trên 50 tế bào tế bào dương tính/1 tiêu bản
Qua bảng 4.8 cho thấy mô hạch và lách của 5 lợn nghiên cứu có giá trị Ct thấp nhất trong các mẫu mô nghiên cứu, cụ thể giá trị Ct của các mẫu hạch và lách của 5 lợn nghiên cứu dao động khoảng từ 15,43 – 20,06 tiếp đến là mẫu
phổi, thận và gan giá trịCt dao động trong khoảng từ 18,34-25,09 và cuối cùng là các mô não, tim, ruột và dạ dày giá trị Ct dao động trong khoảng từ 24,27-38,45. Tương tự, kết quảxác định sự phân bố kháng nguyên virus DTLCP bằng phương pháp hóa mô miễn dịch cho thấy, các mẫu hạch và lách có mức độ phân bố kháng nguyên virus DTLCP cao (từ ++ đến +++) và đều có giá trị Ct thấp và ngược lại. Một số cơ quan như não, tim, ruột, dạ dày ở một số ca bệnh không phát hiện thấy kháng nguyên virus DTLCP bằng phương pháp hóa mô miễn dịch nhưng kết quả kiểm tra virus bằng phương pháp Realtime PCR vẫn cho kết quả dương tínhđiều này có thể lý giải do độ nhạy của phương pháp Realtime PCR và phương pháp hóa mô miễn dịch khác nhau hoặc do trên cùng một mô bệnh phẩm nhưng các vị trí lấy mẫu khác nhau cũng cho kết quả xác định virus khác nhau nhất là các mô bệnh phẩm hàm lượng kháng nguyên virus không cao.
Kết quả này nghiên cứu này cũng phù hợp với khuyến cáo của OIE trong việc lựa chọn mẫu bệnh phẩm phù hợp để phát hiện kháng nguyên virus DTLCP trong đó hạch, lách, phổi và thận là các mẫu bệnh phẩm ưu tiên cho việc phát hiện virus (OIE, 2019).
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1. KẾT LUẬN
Các đặc điểm bệnh lý đặc trưng của lợn mắc bệnh DTLCP thể hiện thể cấp tính và á cấp tính:
- Triệu chứng lâm sàng của lợn mắc bệnh DTLCP: mệt mỏi, ủ rũ, kém ăn (100%), sốt cao 40 - 42oC (100%), có triệu chứng hô hấp như ho, khó thở (73,33%), triệu chứng thần kinh (60,00%), xuất huyết ngoài da ở vùng tai, hông (53,33%), chết đột ngột (10,00%).
- Bệnh tích đại thể của lợn mắc bệnh DTLCP: hạch lympho xuất huyết, phù thũng, màu đỏ sẫm (100%), thận xuất huyết (100%), lách sậm màu sưng to, nhồi huyết (96,66%), màng não xuất huyết (60%), phổi xuất huyết (60,00%,), ruột xuất huyết (53,33%).
- Bệnh tích vi thể đặc trưng của lợn mắc DTLCP là xuất huyết tràn lan ở các cơ quan nội tạng, hoại tử ở nhu mô gan và tế bào lympho và hiện tượng teo, vỡ nhân ở tế bào lympho ở hạch và lách.
- Kháng nguyên virus Dịch tả lợn Châu Phi được phát hiện ở hầu hết các cơ quan của lợn mắc bệnh. Trong đó kháng nguyên được phát hiện ở các tế bào đại thực bào, tế bào đơn nhân ở nhiều cơ quan khác nhau, tế bào gan và tế bào biểu mô ống thận. Sự phân bố kháng nguyên virus DTLCP tập trung nhiều ở các cơ quan như hạch và lách. Các cơ quan phổi, thận và gan mức độ phân bố kháng nguyên đạt trung bình và kháng nguyên phân bố ít ở các cơ quan như não, tim, ruột và dạ dày.
5.2. KIẾN NGHỊ
Kết quả nghiên cứu này là nguồn dữ liệu quan trọng có thể sử dụng trong nghiên cứu bệnh và phục vụ đào tạo; có thể lựa chọn các cơ quan có sự phân bố kháng nguyên virus DTLCP cao để phục vụ công tác chẩn đoán cũng như các nghiên cứu chuyên sâu khác về virus DTLCP.
Tiến hành nghiên cứu với quy mô lớn hơn về các thể bệnh khác trên thực địa nhằm cung cấp các thông tin, dữ liệu cho người chăn nuôi, cán bộ Thú y cơ sở trong công tác phòng chống bệnh DTLCP.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Chi Cục Thú Y Vùng VI (2017). Quy trình phát hiện virus Dich tả lợn Châu Phi bằng kỹ thuật realtime PCR ban hành.
Costard S., Mur L., Lubroth J., Sanchez-Vizcaino J.M. & Pfeiffer D.u. (2013). Epidemiology of African swine fever virus. Virus Research 173 (1): 191–197. De León P., Bustos M. J. & Carrascosa A. L. (2013). Laboratory methods to study
African swine fever virus. Virus Research . 173: 168–79.
Dixon L.K., Chapman D.A.G., Netherton C.L. & Upton C. (2019). African swine fever virus replication and genomics. Virus Research 173 (1): 3–14.
Fauquet C., Fauquet M. & Mayo M.A. (2005). Virus Taxonomy: VIII Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Academic Press.
Fernandez A., Perez J., Carrasco L., Bautista M.J., Vizcaino J.M. and Sierra, M.A. (1992). Distribution of ASFV antigens in pig tissues experimentally infected with two different Spanish virus isolates. Journal of Veterinary Medicine, Series B, 39(110): 393-402.
Francisco J. S. (2020). Comparative Pathology and Pathogenesis of African Swine Fever Infection in Swine. Frontiers in Veterinary Science, 7: 22-29.
Gallardo C. (2019). Attenuated and non haemadsorbing (non‐ HAD) genotype II African swine fever virus (ASFV) isolated in Europe, Latvia 2017. Transbound. Emerg. Dis. 66(3): 1399- 1404.
Gallardo C. (2019). Attenuated and non-haemadsorbing (non-HAD) genotype II African swine fever virus (ASFV) isolated in Europe, Latvia 2017. Transbound. Emerg. Dis., 66(3):1399- 1404.
Gallardo C., Soler A., Rodze I., Nieto R., Cano-Gómez C., Fernandez-Pinero J., Arias M. (2019). Attenuated and non-haemadsorbing (non-HAD) genotype II African swine fever virus (ASFV) isolated in Europe, Latvia 2017. Transbound. Emerg. Dis. doi: 10.1111/tbed.13132.
Gomez-Villamandos J. C., Hervas J., Moreno C., Carrasco L., Bautista M. J., Caballero J. M., Wilkinson P. J. & M. A. Sierra (1997). Subcellular changes in the tonsils of pigs infected with acute African swine fever virus. Vet Research . 28:179–189. Gómez-Villamandos J.C., Hervás J., Méndez A., Carrasco L., de las Mulas J.M.,
Villeda C.J., Wilkinson P.J. and Sierra M.A. (1995). Experimental African swine fever: apoptosis of lymphocytes and virus replication in other cells. Journal of General Virology, 76(9): 2399-2405.
Huyền Trang (2019). Các đường lây nhiễm bệnh DTLCP và cách phòng ngừa hiệu quả.Tạp chí chăn nuôi (5): 1 -2.
Katjaischulz C., Christophi S. & Sandraiblome S. (2017). African and classical swine fever: similarities,differences and epidemiological consequences. Vet Research 48: 48.
Le V.P., Jeong D.G., Yoon S.W., Kwon H.M., Trinh T.B.N. & Nguyen T.L. (2019). Outbreak of African swine fever, Vietnam. Emerging infectious disease.
Mínguez I., Rueda A., Domínguez J., Sánchez-Vizcaíno JM. (1988). Double labeling immunohistological study of African swine fever virus-infected spleen and lymph nodes. Veterinary Pathology, 25(3):193-198.
Montgomery R.E. (1921). On a form of swine fever occurring in British East Africa. J. Comp. Pathol. 34: 59–191.
Nguyễn Bá Hiên & Huỳnh Thị Mỹ Lệ (2011), Giáo trình Bệnh truyền nhiễm thú y. NXB Nông Nghiệp, Hà Nội.
Nguyễn Đăng Thọ (2019). Các phương pháp chẩn đoán Dịch tả lợn Châu Phi. Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y (3): 71 – 83.
Penrith M.L., Thomson G. R. & Bastos A.D.S. (2004). African swine fever. In Infectious diseases of livestock, 2: 1088–1119.
Plowright W., Thomson G. R., Neser J. A. (1994). African swine fever. In Infectious diseases of livestock, with special reference to southern Africa, 1: 567–599. Reis A.L., Abrams C.C., Goatley L.C., Netherton C., Chapman D.G., Sanchez-Cordon
P. & Dixon L.K. (2016). Deletion of African swine fever virus interferon inhibitors from the genome of a virulent isolate reduces virulence in domestic pigs and induces a protective response. Vaccine, 34:4698-4705.
Sánchez-Vizcaíno J.M., Mur L., Gomez - Villamandos J.C. & Carrasco L. (2015). An update on the epidemiology and pathology of African swine fever. J Comp Pathol. 152(1):9-21.
Schloer G.M. (1985). Polypeptides and structure of African swine fever virus. Virus Research . 3(4): 295-310.
Tignon M., Gallardo C., Iscari C., Hutet E., Van der Y., Kolvasov D., De mia G.M., Le Potier M.F., Bishop R.P., Arias M. & Koenen F. (2011). Development and inter- laboratory validation study of an improved new real-time PCR assay with internal control for detection and laboratory diagnosis of African swine fever virus. J. Virol. Methods, 178:161–167.
Trần Thị Thanh Hà (2019). Nghiên cứu phân lập virus Dịch tả lợn Châu Phi. Tạp chí khoa học kỹ thuật thú y (4):46-49.
Vallée I., Stephen W. G. Tait & Penelope P. P. (2001). African Swine Fever Virus Infection of Porcine Aortic Endothelial Cells Leads to Inhibition of Inflammatory Responses, Activation of the Thrombotic State, and Apoptosis. J Virol. 75(21): 10372–10382.
Wilkinson P.J., Wardley R.C. & Williams S.M. (1981). African swine fever virus (Malta/78) in pigs. J. Comp. Pathol. 91 (2):277–284.
World Organisation for Animal Health (2019). Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. OIE, Paris.