Go taq Green 12.5 Mẫu DNA 5 Mồi xuôi 0.5 Mồi ngược 0.5
Nước khử ion (DEPC – treated) 6
Tổng thể tích 25
Cặp mồi được sử dụng trong phản ứng PCR phát hiện PCV2:
Stt Tác nhân
gây bệnh Tên mồi Trình tự mồi
1 Virus Circo PCV2F 5’- GAA GAA TGG AAG AAG CGG -3’ 2 PCV2R 5’ - GTC ACA GCA GTA GAC AGG T-3
Chu kỳ của phản ứng nhiệt PCR cho phản ứng PCR phát hiện PCV2
Giai đoạn Bước tổng hợp Nhiệt độ (oC) Thời gian Chu kỳ
1 Duỗi mạch 95 2 phút 1 2 Duỗi mạch 95 30 giây 35 Gắn mồi 48 1 phút Tổng hợp sợi mới 72 1 phút 3 Hoàn chỉnh 2 10 phút 1 4 Giữ sản phẩm 4 ∞
Điện di sản phẩm PCR (các bước tiến hành giống với phương pháp điện di sản phẩm RT-PCR đã trình bày ở trên).
3.6.7. Phương pháp phânlập vi khuẩn
Phương pháp phân lập vi khuẩn P. multocida, H. parasuis, A. pleuropneumonia được thực hiện theo tiêu chuẩn cơ sở, thường quy của Phòng thí nghiệm trọng điểm CNSH Thú y, Khoa Thú y.
3.6.8. Phương pháp làm tiêu bản vi thể
Từ những mẫu bệnh phẩm có các biến đổi đại thểđược lấy mẫu ngâm trong formol trung tính 10% để làm tiêu bản vi thể. Cần tiến hành làm tiêu bản để xác định bệnh tích vi thể chủ yếu của bệnh. Phương pháp làm tiêu bản vi thể theo quy trình tẩm đúc bằng parafin, nhuộm Haematoxilin - Eosin (HE) tại Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ sinh học Thú y. Các bước của quá trình làm tiêu bản vi thểnhư sau:
3.6.8.1. Cố định mẫu
- Mẫu bệnh phẩm sau khi mổ khám được ngâm ngập trong formol 10%, Sau 24 giờ thay formol mới với thể tích gấp 10-20lần thể tích bệnh phẩm.
- Sau khi bản quản trong formol 10% từ 5-7 ngày, kiểm tra tổ chức đã chín thì tiến hành lấy tổ chức ra khỏi bình formol 10%, cắt thành các miếng nhỏ theo kích thước 1cm x 0.5cm x 0,3cm, cố định trong casset block rồi tiếp tục cho ngâm ngập trong dung dịch formol 10%. Mẫu mô làm hóa mô miễn dịch cốđịnh trong formol tối thiểu 1 tuần và tối đa 2 tuần thì chuyển đúc vào parafin (yêu cầu thể tích dung dịch cốđịnh gấp ít nhất 10 lần thể tích bệnh phẩm).
3.6.8.2. Chuyển đúc
a. Rửa formol
Đem rửa nước chảy nhẹ 1 giờ, để rửa sạch hết formol.
b. Khử nước Cho qua hệ thống cồn: + Cồn 700 1: 15 phút + Cồn 700 2: 2 giờ + Cồn 800: 2 giờ + Cồn 900: 2 giờ + Cồn 1000: 2 giờ + Cồn 1000: Qua đêm c. Khử cồn
Cho qua hệ thống 3 lọ xylen: + Xylen 1: 1,5 giờ
+ Xylen 2: 1,5 giờ + Xylen 3: 1,5 giờ
d. Khử xylen - tẩm paraffin
Cho mẫu vào paraffin nóng chảy + Paraffin 1: 1,5 giờ
e. Đúc block
+ Chuẩn bị: máy đúc block, khuôn block, paraffin sạch nóng chảy ở 580C + Tiến hành:
- Đặt miếng bệnh phẩm vào ngăn chứa paraffin lỏng
- Đổ paraffin lỏng vào khuôn, dùng kẹp hơ nóng nhúng nhanh vào ngăn chứa bệnh phẩm, gắp miếng bệnh phẩm đặt vào khuôn. Đặt vào chính giữa, để vào chính giữa, để miếng bệnh phẩm nằm theo ý muốn.
- Đặt khuôn đã đúc sang bàn lạnh của máy làm nguội block. Để nguội từ từ đến khi đông cứng, đặc chắc là được.
3.6.8.3. Cắt và dán mảnh
- Cắt bằng máy microtocom với độ dày 3 µm, sao cho mảnh cắt không rách nát phần tổ chức là được.
- Tãi và dán mảnh qua bình nước lạnh (nước cất 2 lần ở nhiệt độ phòng) và bình nước ấm (450C). Khi thấy mảnh cắt duỗi ra hoàn toàn phẳng, không bị nhăn, rách, không có vết xước của dao cắt có thể dùng phiến kính vớt lên, để cho nghiêng hết nước rồi đặt lên máy phiến nhiệt để làm khô tiêu bản (ít nhất 2 giờ) là có thểđem nhuộm được.
Nhuộm tiêu bản gồm các bước:
+ Khử parafin: cho tiêu bản qua hệ thống xylen gồm 3 lọ: Xylen i: 6h
Xylen ii: 6h Xylen III: 12h
+ Khử xylen: cho tiêu bản qua hệ thống cồn gồm 4 lọ: Cồn 1000: 2lần (mỗi lần 1 phút)
Cồn 950: 1 lần Cồn 700: 1 lần Cồn 500: 1 lần
+ Khử cồn: cho dưới vòi nước chảy 15 phút. + nhuộm Haematoxylin (nhuộm nhân)
Khi nhấc tiêu bản ra khỏi nước lau khô xung quanh tiêu bản, nhỏ haematoxylin ngập tiêu bản. Để trong khoảng hơn 5 phút sau đó đổ thuốc nhuộm đi, rửa qua nước. Đem lau sạch nước xung quanh tiêu bản và vẩy khô đi. Kiểm tra màu sắc, nếu thấy tiêu bản xanh tím là được.
Nếu nhạt màu thì nhúng tiêu bản qua NaHcO3 1% (30 giây). Nếu đậm quá thì nhúng tiêu bản vào lọ cồn axit (cồn 960 + Hcl 1%) trong 30 giây.
Sau khi điều chỉnh màu ta rửa sạch tiêu bản bằng nước cất. Sau đó cho tiêu bản qua hệ thống cồn: Cồn 500: 1 lần Cồn 700: 1 lần Cồn 950: 1 lần Cồn 1000: 2 lần Rửa tiêu bản bằng nước cất.
+ Nhuộm Eosin (nhuộm bào tương)
Nhỏ Eosin ngập tiêu bản khoảng 5-10 phút tuỳ theo thực tế màu Eosin. Sau đó rửa nước chảy 15 phút cho hết Eosin thừa bám trên phiến kính.
Cho tiêu bản qua hai lọ cồn 1000 mỗi lọ 1 phút.
+ Tẩy cồn, làm trong tiêu bản: cho tiêu bản đi qua hai lọ xylen mỗi lọ 3 phút.
- Gắn Baume canada:
Nhỏ một giọt Baume canada lên lamen rồi gắn nhanh lên tiêu bản khi vẫn còn xylen trên tiêu bản. Ấn nhẹđể dồn hết bọt khí ra ngoài.
- Đánh giá kết quả:
Đem soi lên kính hiển vi quang học vật kính 10. Nếu thấy nhân bắt màu xanh tím, bào tương bắt màu đỏtươi, tiêu bản trong sáng, không có nước, không có bọt khí là được.
3.6.9. Phương pháp hóa mô miễn dịch
Bước 1: Làm sạch tiêu bản
- Khử parafin bằng cách ngâm tiêu bản trong 3 bình xylen mỗi bình ngâm 10 phút.
+ Cồn 1000 : 30 giây + Cồn 950 1: 30 giây + Cồn 950 2: 30 giây + Cồn 950 3: 30 giây + Cồn 90: 30 giây + Cồn 80: 30 giây
- Rửa nước tiêu bản 10 phút
Bước 2: Hoạt hoá enzym
- Ngâm ngập tiêu bản và hấp trong Citrat buffer pH=6 ở 1210C trong 15 phút. Để nguội tự nhiên.
- Rửa PBS 1X 3 lần (5 phút/lần).
Bước 3: Khử peroxydase nội sinh
- Dùng H2O2 30% trong dung môi Methanol theo tỉ lệ 1: 9, ngâm tiêu bản trong 30 phút.
- Rửa PBS 1X 3 lần (5 phút/lần).
Bước 4: Gắn kháng thể
- Nhỏ kháng thể kháng DTLCP lên tiêu bản. - Để tủấm 370C/1giờ hoặc 40C/qua đêm.
- Rửa tiêu bản bằng dung dịch PBS 3 lần (5 phút/lần)
Bước 5: Gắn kháng kháng thể
- Nhỏ kháng kháng thể lên tiêu bản. - Để tủấm 370C/1 giờ.
- Rửa PBS 3 lần (5 phút/lần).
Bước 6: Cho cơ chất
- Ngâm tiêu bản trong dung dịch DAB khoảng 5 phút.
- Kiểm tra dưới kính hiển vi thường. Nếu thấy xuất hiện màu vàng nâu nhạt trên lát cắt có thể ngâm thêm 1-2 phút, dừng phản ứng bằng nước sạch.
Bước 7: Đọc kết quả
- Nhuộm nhân tế bào bằng Hematoxilin, làm sạch, gắn Baume canada và quan sát bằng kính hiển vi quang học. Nếu tiêu bản xuất hiện màu vàng nâu là dương tính, tiêu bản không có màu vàng nâu là âm tính.
3.6.10. Phương pháp xử lý số liệu
Tính toán kết quả: Tỷ lệ nhiễm (tỷ lệdương tính) tính theo công thức: Số mẫu dương tính
Tỷ lệ nhiễm (%) = x 100 Số mẫu xét nghiệm
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. KẾT QUẢ THU THẬP MẪU CA BỆNH, SÀNG LỌC VÀ XÁC ĐỊNH
MỘTSỐTRIỆUTRỨNG LÂM SÀNG CỦALỢNMẮCBỆNH DTLCP
4.1.1. Kết quả thu thập ca bệnhphẩm và sànglọc lợn mắc bệnh DTLCP đạt
tiêu chuẩn nghiên cứu
Trong thời gian nghiên cứu, các mẫu ca bệnh của 70 lợn nghi mắc bệnh DTLCP đã được thu thập từ các trang trại, cơ sở chăn nuôi lợn ở các tỉnh phía Bắc. Do lợn mắc bệnh DTLCP không được vận chuyển lợn, nhóm nghiên cứu đã tiến hành mổ khám tại các hố chôn chuẩn bị tiêu hủy hoặc tại trại có dịch được sự cho phép của cơ quan, chính quyền địa phương. Mỗi trại có lợn nghi mắc bệnh DTLCP mổ từ 1-2 con đồng thời, thu thập đầy đủ thông tin từ trại có các ca bệnh nghiên cứu. Hồ sơ bệnh án từng ca bệnh được tổng hợp từ thông tin cung cấp của các chủ bệnh súc, kỹ thuật trại và được lưu tại phòng thí nghiệm. Kết quả thu thập mẫu lợn nghi mắc bệnh DTLCP trình bày tại bảng 4.1.