Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ
95oC 2 phút 01
95oC 15 giây 45
60oC 45 giây
(ghi nhận tín hiệu huỳnh quang) 45 Đọc kết quả phản ứng Realtime PCR
Kết quả của phản ứng Realtime PCR được xác định dựa vào chu kỳngưỡng (Cycle threshold: Ct).
Phản ứng được công nhận khi mẫu đối chứng dương tính (được chẩn độ trước) phải có giá trị Ct tương đương giá trị Ct đã biết (± 2Ct), mẫu đối chứng âm không có Ct.
Với điều kiện phản ứng:
• Mẫu dương tính khi giá trịCt ≤ 35;
• Mẫu ấm tính khi không có giá trị Ct;
• Mẫu nghi ngờ khi giá trị Ct >35.
Đánh giá kết quả: mẫu có virus DTLCP khi kết quả Realtime PCR dương tính. Với những mẫu nghi ngờ cần được thực hiện lại xét nghiệm hoặc sử dụng phương pháp xét nghiệm khác để khẳng định kết quả.
3.6.5. Phương pháp RT-PCR
3.6.5.1. Phương pháp tách chiết DNA/RNA tổng số
Tách chiết DNA/RNA tổng số từ mẫu bệnh phẩm sử dụng Kit chiết tách thương mại. Các bước tách chiết DNA/RNA được thực hiện theo hướng dẫn đi kèm của nhà sản xuất gồm:
1. Lấy 560 µl dung dịch AVL có chứa carrier RNA cho vào ống ly tâm 1.5 ml;
2.Thêm 140 µl mẫu (huyết tương, huyết thanh, dịch nuôi cấy tế bào, dịch swab) vào ống ly tâm trên. Trộn đều bằng máy voltex;
3.Ủở nhiệt độ 15-200C trong 10 phút;
4.Ly tâm để cho các phần dung dịch trên nắp rơi xuống hết ống nghiệm; 5.Thêm 560 µl ethanol (96-100%) vào mẫu, trộn đều bằng máy voltex trong 15giây. Sau đó, spindown toàn bộ dung dịch xuống;
6.Cẩn thận lấy 630 µl dung dịch ở bước 5 cho vào ống Qiaamp Mini (dung tích 2ml). Đậy nắp, ly tâm tốc độ 8000 vòng/phút/1 phút, loại bỏ phần dịch phía dưới;
7.Lặp lại bước 6;
8.Cho 500µl buffer AW1. Đậy nắp, ly tâm tốc độ 8000 vòng/phút/1 phút. Loại bỏ dịch dưới ống;
10. Ly tâm tốc độ 1400 vòng/phút/ 3 phút. Thu được 60 µl dịch chiết ARN tổng số;
11. Bảo quản mẫu RNA ở nhiệt độ -200C.
3.6.5.2. Phương pháp RT- PCR
Các bước tiến hành phản ứng RT – PCR: Mẫu RNA tổng số sau khi tách chiết sẽđược trộn với các thành phần phản ứng được trình bày ở bảng 3.5.
Bảng 3.5. Thành phần phản ứng RT-PCR Thành phần phản ứng Thể tích cần lấy (µl)