3.2. ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
- Địa điểm nghiên cứu: phòng thí nghiệm P111 của Bộ môn bệnh cây, phòng đặt hạt cách ly, Khoa Nông học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam và một số địa điểm thu mẫu vùng Hà Nội và phụ cận
- Thời gian nghiên cứu: từ tháng 04 năm 2019 đến tháng 02 năm 2020.
3.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Nghiên cứu, xác định thành phần và mức độ nhiễm của các loài nấm bệnh trên mẫu hạt giống ngô, đậu tương, lạc vùng Hà Nội và phụ cận năm 2019
- Nghiên cứu đặc điểm hình thái của một số loài nấm phổ biến hại hạt giống ngô, đậu tương, lạc
- Khảo sát hiệu lực ức chế của nấm đối kháng Trichoderma viride với một số loài nấm phổ biến hại hạt giống trên môi trường nhân tạo
- Nghiên cứu hiệu lực của xử lý của nước Javel, NaCl và một số dịch chiết hành tỏi đến mức độ nhiễm các loài nấm trên mẫu hạt giống ngô, lạc, đậu tương
- Khảo sát ảnh hưởng của xử lý nước Javel, NaCl và một số dịch chiết hành tỏi đến tỷ lệ nhiễm các loài nấm và khả năng nảy mầm của các mẫu hạt giống ngô, đậu tương, lạc.
3.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4.1. Phương pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm
* Phương pháp giám định nấm bệnh trên hạt
Sử dụng phương pháp giấy thấm (Blotter paper) theo ISTA, 2001: + Kiểm tra 400 hạt trên mỗi mẫu hạt giống ngô, lạc, đậu tương + Chuẩn bị đĩa Petri nhựa và giấy thấm (đã được khử trùng) + Lấy 3 tờ giấy thấm cắt cho vừa vào đĩa Petri nhựa
+ Cách đặt hạt: đặt 10 hạt/đĩa Petri, đặt thành 2 vòng, vòng ngoài 9 hạt, vòng trong 1 hạt
+ Dùng pipet nhựa tưới lên giấy để giữ ẩm cho hạt
+ Viết nhãn lên đĩa Petri: tên mẫu, ngày tháng giám định hạt
+ Để ẩm hạt trong thời gian 7 ngày ở phòng cách ly, sau đó tiến hành kiểm tra, giám định các loài nấm hại hạt
+ Quan sát, kiểm tra và giám định nấm dưới kính lúp soi nổi và kính hiển vi quang học, soi lần lượt từ vòng ngoài vào vòng trong theo tâm đĩa, đánh dấu mốc kiểm tra và tên nấm bằng bút. Đánh giá mức độ nhiễm nấm và tỷ lệ nảy mầm sau ngày thứ 7 đặt ẩm.
3.4.2. Phương pháp phân lập nấm bệnh hại hạt trên môi trường nhân tạo
Theo phương pháp của Lester W. Burgess và cs., 2009: * Chuẩn bị môi trường nuôi cấy (PGA)
Thành phần:
+ Khoai tây : 200 gram + Đường Gluco: 20 gram + Agar : 20 gram + Nước cất : 1000ml
Chuẩn bị môi trường: Khoai tây gọt vỏ, rửa sạch, thái mỏng thành từng lát, đem đun sôi với nước cất 30 phút, sau đó lọc bằng vải mỏng qua phễu. Cho thêm nước cất đến đủ 1000ml đem đun sôi lại. Cho Agar, đường Gluco khuấy đều cho tan hết, sau đó đổ môi trường vào bình tam giác có đậy nút bạc (bình tam giác, đĩa Petri đã được rửa sạch và sấy khô ở nhiệt độ 160oC trong vòng 1h20 phút). Sau đó, đem khử trùng trong nồi hấp ở áp suất 1,5atm (121oC) trong 50 phút. Đổ môi trường ra các đĩa Petri đã khử trùng, để nguội và bảo quản trong tủ lạnh.
* Phương pháp phân lập nấm bệnh
- Chuẩn bị mẫu bệnh: soi kính hiển vi để xác định chính xác loài nấm bệnh. Chọn những hạt có vết bệnh điển hình, còn tươi mới, gắp riêng ra đĩa đặt giấy thấm đã được khủ trùng bằng cồn
- Kỹ thuật nuôi cấy: dụng cụ cấy nấm khử trùng bằng cồn 70o và hơ trên ngọn lửa đèn cồn, sau khi nguội tiến hành cấy hạt bị bệnh lên môi trường. Đĩa Petri sau khi cấy sẽ được duy trì ở nhiệt độ phòng thí nghiệm dao động khoảng 20-30oC và được quan sát hàng ngày. Toàn bộ quá trình phân lập và cấy nấm được thực hiện trong tủ cấy có ngọn lửa đèn cồn.
3.4.3. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái của 3 loài nấm phổ biến
Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Fusarium spp. hại trên các mẫu hạt giống ngô, lạc, đậu tương
Theo phương pháp nghiên cứu của Mathur, S. B and Olga, K. 2003:
Quan sát, mô tả sự phát triển của nấm trên những mẫu hạt bị bệnh dưới kính hiển vi soi nổi. Phân lập từng loài nấm gây bệnh, nuôi cấy trên môi trường nhân tạo PGA. Quan sát sự phát triển của nấm bệnh trên môi trường nhân tạo bằng kính hiển vi soi nổi và ghi nhận các đặc điểm hình thái của nấm.
3.4.4. Khảo sát hiệu lực ức chế của nấm đối kháng Trichoderma viride với một số loài nấm phổ biến Aspergillusflavus, Aspergillusniger, Fusarium spp. gây hại trên các mẫu hạt giống ngô, lạc, đậu tương trên môi trường nhân tạo
Khảo sát hiệu lực ức chế của nấm đối kháng Trichoderma viride với các loài nấm hại hạt giống được tiến hành theo phương pháp của Saurabh Singh, Asha Sinha & Ravindra Kumar. 2015.
Tiến hành thí nghiệm trên môi trường PGA, ở nhiệt độ 28oC 2oC, gồm 4 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần 3 đĩa Petri:
+ CT1: (Đối chứng) Cấy từng isolate nấm bệnh.
+ CT2 : Cấy nấm đối kháng T. viride trước, sau 24h cấy isolate nấm bệnh. + CT3 : Cấy đồng thời nấm đối kháng T. viride và nấm bệnh.
+ CT4 : Cấy isolate nấm bệnh trước, sau 24h cấy nấm đối kháng T. viride.
Chỉ tiêu theo dõi: quan sát và đo đường kính tản nấm trong 4 ngày sau cấy. Tính hiệu lực ức chế (%) của nấm T. viride với các isolate nấm Aspergillus
Công thức 2,3,4 Công thức đối chứng
Hình 3.4. Sơ đồ thí nghiệm khảo sát hiệu lực ức chế của nấm Trichoderma viride
với các isolate nấm Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Fusarium spp.
Ghi chú:
: Isolate nấm Trichoderma viride
: Isolate nấm Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Fusarium spp.
3.4.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của xử lý nước Javel, NaCl và một số dịch chiết hành tỏi đến mức độ nhiễm các loài nấm Aspergillusflavus, Aspergillus
niger, Fusarium spp. gây hại các mẫu hạt giống ngô, đậu tương, lạc
Khảo sát hiệu lực xử lý hạt giống phòng trừ các loài nấm phổ biến hại hạt giống ngô, lạc, đậu tương theo phương pháp của Akter, N. 2008.
3.4.5.1. Ảnh hưởng của xử lý nước Javel 0.3% đến sự phát triển của nấm Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Fusarium spp. trên hạt giống ngô, lạc, đậu tương
Dùng dung dịch Javel 6% pha với nước cất để có được nồng độ dung dịch là 0.3%. Ví dụ: lấy 10 ml dung dịch Javel 6% pha với 200ml nước sẽ thu được 210 ml dung dịch Javel có nồng độ 0.3%.
Ngâm các mẫu hạt giống ngô, lạc, đậu tương trong dung dịch Javel có nồng độ 0.3% trong khoảng thời gian là 30 giây, sau đó chắt dung dịch đi và tiếp tục ngâm với nước trong khoảng thời gian 15 phút đối với các mẫu hạt giống ngô và 10 phút đối với các mẫu hạt giống lạc và đậu tương. Sau khi đủ thời gian, chắt hết nước, rửa qua 3 lần với nước sạch, rồi thấm khô hạt qua giấy thấm nước và đặt hạt vào đĩa Petri nhựa đã được đặt giấy thấm.
- Tiến hành thí nghiệm với mỗi mẫu hạt giống là 400 hạt, nhắc lại 1 lần. + CT1: Đối chứng: ngâm hạt trong nước cất 15 phút.
+ CT2: Ngâm hạt trong dung dịch nước Javel 0.3% trong thời gian 30 giây. Đặt ẩm hạt theo phương pháp giám định nấm bệnh trên hạt (mục 3.4.1). - Sau 7 ngày, kiểm tra theo phương pháp giám định bệnh hại hạt giống trên các mẫu hạt giống ngô, lạc và đậu tương
- Chỉ tiêu theo dõi: các loài nấm xuất hiện, tỷ lệ hạt nảy mầm, tỷ lệ hạt nhiễm nấm, khả năng ức chế của dung dịch Javel 0,3% đến sự phát triển của các loài nấm trên hạt giống.
3.4.5.2. Ảnh hưởng của xử lý dung dịch NaCl 2% đến sự phát triển của nấm Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Fusarium spp. trên hạt giống ngô, lạc, đậu tương
Dùng muối tinh trắng có thành phần 100% NaCl pha với tỷ lệ như sau: lấy 20g muối tính pha với 1 lit nước sẽ thu được dung dịch NaCl 2%.
Ngâm các mẫu hạt giống ngô trong dung dịch NaCl có nồng độ 2% trong khoảng thời gian là 15 phút và các mẫu hạt giống lạc, đậu tương trong khoảng thời gian 10 phút. Sau đó chắt dung dịch NaCl đi, rửa qua 3 lần với nước sạch, rồi thấm khô hạt qua giấy thấm nước và đặt hạt vào đĩa Petri nhựa đã được đặt giấy thấm.
Tiến hành thí nghiệm với mỗi mẫu hạt giống là 400 hạt, nhắc lại 1 lần. + CT1: Đối chứng: ngâm hạt trong nước cất 15 phút.
+ CT2: Ngâm hạt trong dung dịch NaCl 2% trong thời gian 15 phút đối với các mẫu hạt giống ngô và 10 phút đối với các mẫu hạt giống lạc và đậu tương.
Đặt ẩm hạt theo phương pháp giám định nấm bệnh trên hạt (mục 3.4.1). - Sau 7 ngày, kiểm tra và đánh giá tỷ lệ nhiễm các loài nấm và khả năng ức chế của dung dịch NaCl 2% đến sự phát triển của các loài nấm trên hạt giống.
3.4.5.3. Ảnh hưởng của xử lý dịch chiết tỏi tím 5% đến sự phát triển của nấm Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Fusarium spp. trên hạt giống ngô, lạc, đậu tương
Tỏi tím bóc vỏ, đem rửa sạch và nghiền nhỏ, chắt lấy dịch, sau đó pha loãng thành nồng độ 5% theo mục đích sử dụng.
Ngâm các mẫu hạt giống ngô ở trong dung dịch chiết tỏi tím ở nồng độ 5% như đã pha trong khoảng thời gian là 15 phút và các mẫu hạt giống lạc, đậu tương trong khoảng thời gian 10 phút. Sau đó chắt dung dịch đi, rửa qua 3 lần với nước sạch, rồi thấm khô hạt qua giấy thấm nước và đặt hạt vào đĩa Petri nhựa đã được đặt giấy thấm.
Tiến hành thí nghiệm với mỗi mẫu hạt giống là 400 hạt, nhắc lại 1 lần. + CT1: Đối chứng: ngâm hạt trong nước cất 15 phút.
+ CT2: Ngâm hạt trong dịch chiết tỏi tím 5% trong thời gian 15 phút đối với các mẫu hạt giống ngô và 10 phút đối với các mẫu hạt giống lạc và đậu tương.
Đặt ẩm hạt theo phương pháp giám định nấm bệnh trên hạt (mục 3.4.1). - Sau 7 ngày, kiểm tra và đánh giá tỷ lệ nhiễm các loài nấm và khả năng ức chế của dịch chiết tỏi tím 5% đến sự phát triển của các loài nấm trên hạt giống.
3.4.5.4. Ảnh hưởng của xử lý dịch chiết tỏi trắng 5% đến sự phát triển của nấm Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Fusarium spp. trên hạt giống ngô, lạc, đậu tương
Tỏi trắng bóc vỏ, đem rửa sạch và nghiền nhỏ, chắt lấy dịch, sau đó pha loãng thành nồng độ 5% theo mục đích sử dụng.
Ngâm các mẫu hạt giống ngô ở trong dung dịch chiết tỏi trắng ở nồng độ 5% như đã pha trong khoảng thời gian là 15 phút và các mẫu hạt giống lạc, đậu tương trong khoảng thời gian 10 phút. Sau đó chắt dung dịch đi, rửa qua 3 lần với nước sạch, rồi thấm khô hạt qua giấy thấm nước và đặt hạt vào đĩa Petri nhựa đã được đặt giấy thấm.
Tiến hành thí nghiệm với mỗi mẫu hạt giống là 400 hạt, nhắc lại 1 lần. + CT1: Đối chứng: ngâm hạt trong nước cất 15 phút.
+ CT2: Ngâm hạt trong dịch chiết tỏi trắng 5% trong thời gian 15 phút đối với các mẫu hạt giống ngô và 10 phút đối với các mẫu hạt giống lạc và đậu tương.
Đặt ẩm hạt theo phương pháp giám định nấm bệnh trên hạt (mục 3.4.1). - Sau 7 ngày, kiểm tra và đánh giá tỷ lệ nhiễm các loài nấm và khả năng ức chế của dịch chiết tỏi trắng 5% đến sự phát triển của các loài nấm trên hạt giống.
3.4.5.5. Ảnh hưởng của xử lý dịch chiết hành tím 5% đến sự phát triển của nấm Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Fusarium spp. trên hạt giống ngô, lạc, đậu tương
Hành tím bóc vỏ, đem rửa sạch và nghiền nhỏ, chắt lấy dịch, sau đó pha loãng thành nồng độ 5% theo mục đích sử dụng.
Ngâm các mẫu hạt giống ngô ở trong dung dịch chiết hành tím ở nồng độ 5% như đã pha trong khoảng thời gian là 15 phút và các mẫu hạt giống lạc, đậu
tương trong khoảng thời gian 10 phút. Sau đó chắt dung dịch đi, rửa qua 3 lần với nước sạch, rồi thấm khô hạt qua giấy thấm nước và đặt hạt vào đĩa Petri nhựa đã được đặt giấy thấm.
- Tiến hành thí nghiệm với mỗi mẫu hạt giống là 400 hạt, nhắc lại 1 lần. + CT1: Đối chứng: ngâm hạt trong nước cất 15 phút.
+ CT2: Ngâm hạt trong dịch chiết hành tím 5% trong thời gian 15 phút đối với các mẫu hạt giống ngô và 10 phút đối với các mẫu hạt giống lạc và đậu tương.
Đặt ẩm hạt theo phương pháp giám định nấm bệnh trên hạt (mục 3.4.1). - Sau 7 ngày, kiểm tra và đánh giá tỷ lệ nhiễm các loài nấm và khả năng ức chế của dịch chiết hành tím 5% đến sự phát triển của các loài nấm trên hạt giống.
3.4.6. Ảnh hưởng của xử lý nước Javel, NaCl và một số dịch chiết hành tỏi đến tỷ lệ nhiễm các loài nấm và khả năng nảy mầm của các mẫu hạt giống ngô, đậu tương, lạc thu thập vùng Hà Nội và phụ cận năm 2019
Chuẩn bị:
- Mẫu hạt giống ngô, đậu tương, lạc - Nước Javel 0.3%
- Nước muối NaCl 2%
- Dịch chiết tỏi tím 5%, tỏi trắng 5%, hành tím 5%.
* Phương pháp nghiên cứu:
Tiến hành thí nghiệm với mỗi mẫu hạt giống là 100 hạt. + CT1: Đối chứng: ngâm hạt trong nước cất 15 phút.
+ CT2: Ngâm hạt trong nước Javel, NaCl và dịch chiết hành tỏi đã chuẩn bị trong thời gian 15 phút. Sau đó chắt dung dịch đi, rửa qua 3 lần với nước sạch, rồi thấm khô hạt qua giấy thấm nước và đặt hạt vào đĩa Petri nhựa đã được đặt giấy thấm.
Sau 7 ngày, kiểm tra và đánh giá tỷ lệ hạt nảy mầm và tỷ lệ hạt nhiễm bệnh ở mỗi công thức.
3.4.7. Chỉ tiêu theo dõi và xử lý số liệu
Tổng số hạt nhiễm nấm
•TLB (%)= --- ×100% Tổng số hạt kiểm tra hoặc lây bệnh nhân tạo
* Hiệu lực ức chế (%) R1 – R2
•PIRG (%) = --- ×100% R1
Trong đó: PIRG : Hiệu lực ức chế (%). R1: Đường kính tản nấm ở công thức đối chứng. R2: Đường kính tản nấm ở công thức thí nghiệm.
*Phương pháp xử lý số liệu
- Các số liệu được xử lý trên máy tính theo chương trình xử lý thống kê IRRISTAT 5.0 và Microsoft Office Excel 2010.
PHẦN 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
4.1. NGHIÊN CỨU, XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN VÀ MỨC ĐỘ NHIỄM CÁC LOÀI NẤM BỆNH TRÊN HẠT GIỐNG NGÔ, ĐẬU TƯƠNG, LẠC VÙNG HÀ NỘI VÀ PHỤ CẬN NĂM 2019
4.1.1. Xác định thành phần và mức độ nhiễm các loài nấm bệnh trên mỗi mẫu hạt giống ngô, đậu tương, lạc thu thập vùng Hà Nội và phụ cận năm 2019
Tiến hành kiểm tra, giám định thành phần nấm gây bệnh trên các mẫu hạt giống ngô, lạc, đậu tương bằng cách sử dụng phương pháp giấy thấm (Blotter paper) theo ISTA, 2001. Kết quảđược trình bày ở bảng 4.1; bảng 4.2; bảng 4.3.
Bảng 4.1. Thành phần và mức độ nhiễm các loài nấm bệnh trên các mẫu hạt giống ngô vùng Hà Nội và phụ cận năm 2019
STT Mẫu hạt
giống
Tỷ lệ hạt (%) nhiễm nấm
A. flavus A. niger Fusarium
spp. Bipolaris spp. Penicillium spp. Curvularia spp. 1 HN88-KX 72.75 24.75 4.25 3 3.50 0.75 2 HN88-HH 72.50 37.75 8.00 3.25 4.25 1.50 3 HN88-TT 77.50 36.50 7.50 4.75 4.25 1.50 4 HN88-VĐ 75.25 24.25 5.00 3.75 3.75 0.00 5 ADI602-KX 72.50 26.50 9.25 0.75 10.00 0.75 6 ADI602-HH 76.25 34.50 6.75 4.75 5.00 2.75 7 ADI602-TT 77.50 33.75 6.25 3.50 3.50 2.00 8 LVN4-TK 73.25 25.00 4.50 3.50 6.00 0.50