Ở Việt Nam, những nghiên cứu về bệnh hại hạt giống và khả năng truyền lan của chúng hiện nay còn rất ít. Một số nghiên cứu đi sâu về bệnh nấm trên hạt giống ngô nhưng chỉ mới tập trung vào một số loài có khả năng gây nguy hiểm cho cả người và động vật.
Kết quả điều tra của Viện Bảo vệ thực vật (BVTV) năm 1967-1968 đã phát hiện loài Aspergillus niger Tiegh. Roger (Viện BVTV, 1976) và tới năm 1977- 1978 phát hiện ra loài Aspergillus flavus Link. Roger thuộc chi Aspergillus sp gây bệnh cho cây trồng ở Việt Nam (Viện BVTV, 1999).
Nấm Aspergillus niger là nấm đất phổ biến cũng là nấm hạt trên hạt điển
hình. Theo Lê Lương Tề (1977), bệnh do nấm Aspergillus niger gây ra trên lạc được gọi là bệnh héo rũ gốc mốc đen, một số tác giả khác thì gọi là bệnh thối đen cổ rễ hay bệnh thối cổ rễ. Là nấm hoại sinh, nấm Aspergillus niger ngoài tồn tại trên củ, hạt, trong đất, trên tàn dư cây trồng và còn tồn tại cả trong điều kiện không khí nhiều bụi bặm.
Nguyễn Phùng Tiến và cs. (1983) đã nghiên cứu mức độ nhiễm mốc trên ngô, kết quả là 38 mẫu bảo quản trong kho lương thực của thành phố Thanh Hóa đã nhiễm nấm mốc thuộc các chi sau: Aspergillus, Cladosporium, Penillium,
Sporotrichuro, Saccharomycess, Trichooderme viride, Geotrichum.
Tác giả Đậu Ngọc Hào và Nguyễn Thị Thuận (1994) đã nghiên cứu mức nhiễm mốc và aflatoxin trên ngô của các tỉnh Sơn La và Thanh Hóa. Kết quả
phân tích của 24 mẫu ngô hạt và 24 mẫu ngô bột cho thấy các mẫu này đã nhiễm nhiễm A. flavus với tỷ lệ từ 50-80%. Các loài như Aspergillus glaucus,
Aspergillus candidus cũng nhiễm với tỷ lệ khá cao. Loài Aspergillus ochraceus
đã phát hiện thấy ở tỷ lệ thấp. Các loài của chi Fusarium đã nhiễm với tỷ lệ 15%. Kết quả nghiên cứu mức nhiễm aflatoxin ở các mẫu ngô trên đã cho thấy là 33% mẫu ngô hạt đã nhiễm aflatoxin B1 từ 10- 40 ppb, 8.3% số mẫu nhiễm aflatoxin B2 từ 10-20 ppb, 72% số mẫu ngô bột đã nhiễm aflatoxin B1 từ 25–250 ppb, 9,5% số mẫu nhiễm aflatoxin B2 từ 10-20 ppb.
Tác giả Nguyễn Thị Ly và Phan Bích Thu (1993) đã xác định có khoảng 33%-85% số mẫu lạc kiểm tra có khả năng sản sinh độc tố aflatoxin. Kết quả điều tra thành phần bệnh chết héo lạc ở miền Bắc Việt Nam đã xác định được 10 loài vi sinh vật gây bệnh héo, trong đó có 2 loài nấm gây bệnh xuất hiện phổ biến thuộc nhóm loài Aspergilllus sp. là Aspergillus flavus và Aspergillus niger.
Nguyễn Thụy Châu và cs. (1995) đã nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc và aflatoxin trên nông sản của Việt Nam. Mức độ nhiễm aflatoxin trên ngô và gạo ở một số địa phương cho thấy tần suất nhiễm aflatoxin trên ngô ở miền Nam và miền Bắc Việt Nam là cao từ 73,3%-95,8% trong đó hàm lượng aflatoxin trung bình cao nhất là 63,8ppb và hàm lượng aflatoxin trung bình thấp nhất là 16,25 ppb đối với các tỉnh khác nhau.
Kết quả nghiên cứu thành phần bệnh ngô của Viện BVTV (1967-1968),đã phát hiện 32 loại bênh trên ngô gồm 30 loại do nấm, 2 loại bệnh sinh lý, trong đó bệnh sợi đen ngô (Sphacelotheca reiliama) được phát hiện tại Hà Giang, Bắc Thái, Lạng Sơn và Nghệ An.
Kết quả thành phần bệnh ngô của viện BVTV (1973-1975), đã phát hiện 34 bệnh hại tại miền Bắc Việt Nam, trong đó có 26 bệnh do nấm. Bệnh sợi đen
ngô (Sphacelotheca reiliama) được phát hiện tại Lạc Thủy-Hòa Bình. Đến năm
1977-1978 bệnh lần đầu tiên được phát hiện ở các tỉnh phía nam là Lâm Đồng và Đồng Nai.
Ngô Bích Hảo kết hợp với Viện Nghiên cứu bệnh hạt giống Đan Mạch điều tra giám định thành phần nấm bệnh hại hạt giống ngô sản xuất trong nước và nhập khẩu cho thấy các loài nấm phổ biến trên hạt giống ngô gồm có: F.
moniliforme, F. graminearum, F. subglutians, B. maydis, Penicillium sp. và
Theo tài liệu nghiên cứu của Ngô Bích Hảo (năm 2007) chỉ ra rằng có 6 loại nấm chính gây bệnh trên hạt giống đậu tương ở Việt Nam gồm: bệnh thối hạt đậu tương (Macrophomina phaseolina), bệnh thán thư đậu tương (Colletotrichum
truncatum), bệnh đốm lá đậu tương (Cercospora sojina), bệnh đốm tím hạt đậu
tương (Cercospora kikuchii), sương mai đậu tương (peronospora manshurica),
thối hạt (Phomopsis vexans).
Theo Trần Văn Điền(2007), Đậu tương là cây trồng lấy hạt, cây có dầu quan trọng bậc nhất trên thế giới, đứng hàng thứ 4 sau cây lúa mì, lúa nước và ngô. Do khả năng thích ứng rộng nên nó đã được trồng ở khắp năm châu lục, nhưng tập trung nhiều nhất ở châu Mỹ trên 70%, tiếp đến là châu Á.
Phần lớn các loài nấm bệnh trên hạt giống thuộc các nhóm bán ký sinh và bán hoại sinh, một số ít trong số chúng là ký sinh chuyên tính. Nhiều loài nấm trong số chúng còn có khả năng sản sinh độc tố mà tiêu biểu và quan trọng nhất trong số đó là nhóm các loài nấm Aspergilus sp., Fusarium sp. và Penicilium sp. Ở những vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, số lượng các loài trong 3 nhóm trên không chỉ giới hạn xuất hiện trên lương thực dạng hạt mà còn trên cả các sản phẩm chế biến từ hạt. Hiện tại đã xác định và mô tả được khoảng 15 loài
Aspergilus, 9 loài Fusarium và 18 loài Penicilium có khả năng sinh độc tố và
những hợp chất thứ cấp khác. Khi dùng phương pháp agar plug và phương pháp HPLC người ta đã xác định được 74 loại độc tố sản sinh từ 3 nhóm trên (Kulwant Singh, 1991). Điển hình là các loài thuộc nhóm Aspegillus sp., chúng có thể sản sinh các độc tố gây ra nhiều bệnh nguy hiểm cho con người và vật nuôi.
PHẦN 3. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
- Các mẫu hạt giống ngô, đậu tương, lạc được thu thập vùng Hà Nội và phụ cận, hạt giống được thu thập ở các cửa hàng giống cây trồng vùng Hà Nội và phụ cận. (Bảng 3.1 và hình 3.1).
- Môi trường nhân tạo PGA
- Các dụng cụ trong phòng thí nghiệm bao gồm: khay chia mẫu, dụng cụ đếm mẫu, panh, túi nilon hoặc túi giấy bảo quản mẫu các kích thước khác nhau, nhãn ghi mẫu, chày và cối bằng sứ, đĩa Petri nhựa,…
Hình 3.1. Các mẫu hạt giống ngô, đậu tương, lạc thu thập vùng Hà Nội và phụ cận năm 2019
- Những nguyên liệu làm chế phẩm xử lý: nước Javel, NaCl, hành tím, tỏi tím, tỏi trắng... (hình 3.2)
- Nguồn nấm đối kháng Trichoderma viride do Bộ môn Bệnh cây, Khoa Nông học cung cấp (Bảng 3.2 và hình 3.3).
Hình 3.2. Các mẫu hành tỏi dùng trong xử lý hạt giống ngô, đậu tương, lạc thu thập vùng Hà Nội và phụ cận năm 2019
Bảng 3.1. Danh mục các mẫu hạt giống ngô, đậu tương, lạc thu thập vùng Hà Nội và phụ cận năm 2019
Mẫu hạt
giống STT Tên giống Địa điểm thu mẫu
Thời gian thu thập mẫu
Ngô
1 HN88 Kiến Xương – Thái Bình 20/03/2019
2 HN88 Hưng Hà – Thái Bình 20/03/2019
3 HN88 Thái Thụy – Thái Bình 20/03/2019
4 HN88 Văn Đức – Gia Lâm – Hà Nội 13/03/2019
5 ADI602 Kiến Xương – Thái Bình 20/03/2019
6 ADI602 Hưng Hà – Thái Bình 20/03/2019
7 ADI602 Thái Thụy – Thái Bình 20/03/2019
8 LVN4 Tứ Kỳ - Hải Dương 12/04/2019
9 LVN4 Quỳnh Phụ - Hải Dương 12/04/2019
10 LVN4 Ninh Giang – Hải Dương 12/04/2019
11 LVN4 Phú Thị - Gia Lâm – Hà Nội 13/03/2019
12 NK4300 Văn Đức – Gia Lâm – Hà Nội 13/03/2019
13 VN556 Cổ Bi – Gia Lâm – Hà Nội 13/03/2019
14 LVN61 Phú Thị - Gia Lâm – Hà Nội 13/03/2019
Đậu tương
15 DT84 Kiến Xương – Thái Bình 20/03/2019
16 DT84 Hưng Hà – Thái Bình 20/03/2019
17 DT84 Thái Thụy – Thái Bình 20/03/2019
18 DT84 Phú Thị - Gia Lâm – Hà Nội 13/03/2019
19 DT12 Tứ Kỳ - Hải Dương 12/04/2019
20 DT12 Quỳnh Phụ - Hải Dương 12/04/2019
21 DT12 Ninh Giang – Hải Dương 12/04/2019
22 DT12 Phú Thị - Gia Lâm – Hà Nội 13/03/2019
23 Đ9804 Văn Đức – Gia Lâm – Hà Nội 13/03/2019
24 Đ2101 Cổ Bi – Gia Lâm – Hà Nội 13/03/2019
Lạc
25 L29 Kiến Xương – Thái Bình 20/03/2019
26 L29 Hưng Hà – Thái Bình 20/03/2019
27 L29 Thái Thụy – Thái Bình 20/03/2019
28 L27 Văn Đức – Gia Lâm – Hà Nội 13/03/2019
Bảng 3.2. Danh mục các isolate nấm đối kháng Trichoderma viride sử dụng trong thí nghiệm
STT Các isolate nấm Trichoderma viride Ký hiệu
1 Nấm T. viride gốc – Bộ môn Bệnh cây TV-G
2 Nấm T. viride 1 – Bộ môn Bệnh cây TV-1
3 Nấm T. viride 2 – Bộ môn Bệnh cây TV-2
4 Nấm T. viride 3 – Bộ môn Bệnh cây TV-3
Hình 3.3. Các isolate nấm đối kháng Trichoderma viride sử dụng thí nghiệm
3.2. ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
- Địa điểm nghiên cứu: phòng thí nghiệm P111 của Bộ môn bệnh cây, phòng đặt hạt cách ly, Khoa Nông học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam và một số địa điểm thu mẫu vùng Hà Nội và phụ cận
- Thời gian nghiên cứu: từ tháng 04 năm 2019 đến tháng 02 năm 2020.
3.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Nghiên cứu, xác định thành phần và mức độ nhiễm của các loài nấm bệnh trên mẫu hạt giống ngô, đậu tương, lạc vùng Hà Nội và phụ cận năm 2019
- Nghiên cứu đặc điểm hình thái của một số loài nấm phổ biến hại hạt giống ngô, đậu tương, lạc
- Khảo sát hiệu lực ức chế của nấm đối kháng Trichoderma viride với một số loài nấm phổ biến hại hạt giống trên môi trường nhân tạo
- Nghiên cứu hiệu lực của xử lý của nước Javel, NaCl và một số dịch chiết hành tỏi đến mức độ nhiễm các loài nấm trên mẫu hạt giống ngô, lạc, đậu tương
- Khảo sát ảnh hưởng của xử lý nước Javel, NaCl và một số dịch chiết hành tỏi đến tỷ lệ nhiễm các loài nấm và khả năng nảy mầm của các mẫu hạt giống ngô, đậu tương, lạc.
3.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4.1. Phương pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm
* Phương pháp giám định nấm bệnh trên hạt
Sử dụng phương pháp giấy thấm (Blotter paper) theo ISTA, 2001: + Kiểm tra 400 hạt trên mỗi mẫu hạt giống ngô, lạc, đậu tương + Chuẩn bị đĩa Petri nhựa và giấy thấm (đã được khử trùng) + Lấy 3 tờ giấy thấm cắt cho vừa vào đĩa Petri nhựa
+ Cách đặt hạt: đặt 10 hạt/đĩa Petri, đặt thành 2 vòng, vòng ngoài 9 hạt, vòng trong 1 hạt
+ Dùng pipet nhựa tưới lên giấy để giữ ẩm cho hạt
+ Viết nhãn lên đĩa Petri: tên mẫu, ngày tháng giám định hạt
+ Để ẩm hạt trong thời gian 7 ngày ở phòng cách ly, sau đó tiến hành kiểm tra, giám định các loài nấm hại hạt
+ Quan sát, kiểm tra và giám định nấm dưới kính lúp soi nổi và kính hiển vi quang học, soi lần lượt từ vòng ngoài vào vòng trong theo tâm đĩa, đánh dấu mốc kiểm tra và tên nấm bằng bút. Đánh giá mức độ nhiễm nấm và tỷ lệ nảy mầm sau ngày thứ 7 đặt ẩm.
3.4.2. Phương pháp phân lập nấm bệnh hại hạt trên môi trường nhân tạo
Theo phương pháp của Lester W. Burgess và cs., 2009: * Chuẩn bị môi trường nuôi cấy (PGA)
Thành phần:
+ Khoai tây : 200 gram + Đường Gluco: 20 gram + Agar : 20 gram + Nước cất : 1000ml
Chuẩn bị môi trường: Khoai tây gọt vỏ, rửa sạch, thái mỏng thành từng lát, đem đun sôi với nước cất 30 phút, sau đó lọc bằng vải mỏng qua phễu. Cho thêm nước cất đến đủ 1000ml đem đun sôi lại. Cho Agar, đường Gluco khuấy đều cho tan hết, sau đó đổ môi trường vào bình tam giác có đậy nút bạc (bình tam giác, đĩa Petri đã được rửa sạch và sấy khô ở nhiệt độ 160oC trong vòng 1h20 phút). Sau đó, đem khử trùng trong nồi hấp ở áp suất 1,5atm (121oC) trong 50 phút. Đổ môi trường ra các đĩa Petri đã khử trùng, để nguội và bảo quản trong tủ lạnh.
* Phương pháp phân lập nấm bệnh
- Chuẩn bị mẫu bệnh: soi kính hiển vi để xác định chính xác loài nấm bệnh. Chọn những hạt có vết bệnh điển hình, còn tươi mới, gắp riêng ra đĩa đặt giấy thấm đã được khủ trùng bằng cồn
- Kỹ thuật nuôi cấy: dụng cụ cấy nấm khử trùng bằng cồn 70o và hơ trên ngọn lửa đèn cồn, sau khi nguội tiến hành cấy hạt bị bệnh lên môi trường. Đĩa Petri sau khi cấy sẽ được duy trì ở nhiệt độ phòng thí nghiệm dao động khoảng 20-30oC và được quan sát hàng ngày. Toàn bộ quá trình phân lập và cấy nấm được thực hiện trong tủ cấy có ngọn lửa đèn cồn.
3.4.3. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái của 3 loài nấm phổ biến
Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Fusarium spp. hại trên các mẫu hạt giống ngô, lạc, đậu tương
Theo phương pháp nghiên cứu của Mathur, S. B and Olga, K. 2003:
Quan sát, mô tả sự phát triển của nấm trên những mẫu hạt bị bệnh dưới kính hiển vi soi nổi. Phân lập từng loài nấm gây bệnh, nuôi cấy trên môi trường nhân tạo PGA. Quan sát sự phát triển của nấm bệnh trên môi trường nhân tạo bằng kính hiển vi soi nổi và ghi nhận các đặc điểm hình thái của nấm.
3.4.4. Khảo sát hiệu lực ức chế của nấm đối kháng Trichoderma viride với một số loài nấm phổ biến Aspergillusflavus, Aspergillusniger, Fusarium spp. gây hại trên các mẫu hạt giống ngô, lạc, đậu tương trên môi trường nhân tạo
Khảo sát hiệu lực ức chế của nấm đối kháng Trichoderma viride với các loài nấm hại hạt giống được tiến hành theo phương pháp của Saurabh Singh, Asha Sinha & Ravindra Kumar. 2015.
Tiến hành thí nghiệm trên môi trường PGA, ở nhiệt độ 28oC 2oC, gồm 4 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần 3 đĩa Petri:
+ CT1: (Đối chứng) Cấy từng isolate nấm bệnh.
+ CT2 : Cấy nấm đối kháng T. viride trước, sau 24h cấy isolate nấm bệnh. + CT3 : Cấy đồng thời nấm đối kháng T. viride và nấm bệnh.
+ CT4 : Cấy isolate nấm bệnh trước, sau 24h cấy nấm đối kháng T. viride.
Chỉ tiêu theo dõi: quan sát và đo đường kính tản nấm trong 4 ngày sau cấy. Tính hiệu lực ức chế (%) của nấm T. viride với các isolate nấm Aspergillus
Công thức 2,3,4 Công thức đối chứng
Hình 3.4. Sơ đồ thí nghiệm khảo sát hiệu lực ức chế của nấm Trichoderma viride
với các isolate nấm Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Fusarium spp.
Ghi chú:
: Isolate nấm Trichoderma viride
: Isolate nấm Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Fusarium spp.
3.4.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của xử lý nước Javel, NaCl và một số dịch chiết hành tỏi đến mức độ nhiễm các loài nấm Aspergillusflavus, Aspergillus
niger, Fusarium spp. gây hại các mẫu hạt giống ngô, đậu tương, lạc
Khảo sát hiệu lực xử lý hạt giống phòng trừ các loài nấm phổ biến hại hạt giống ngô, lạc, đậu tương theo phương pháp của Akter, N. 2008.
3.4.5.1. Ảnh hưởng của xử lý nước Javel 0.3% đến sự phát triển của nấm Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Fusarium spp. trên hạt giống ngô, lạc, đậu tương
Dùng dung dịch Javel 6% pha với nước cất để có được nồng độ dung dịch là 0.3%. Ví dụ: lấy 10 ml dung dịch Javel 6% pha với 200ml nước sẽ thu được 210 ml dung dịch Javel có nồng độ 0.3%.
Ngâm các mẫu hạt giống ngô, lạc, đậu tương trong dung dịch Javel có nồng độ 0.3% trong khoảng thời gian là 30 giây, sau đó chắt dung dịch đi và tiếp tục ngâm với nước trong khoảng thời gian 15 phút đối với các mẫu hạt giống ngô và 10 phút đối với các mẫu hạt giống lạc và đậu tương. Sau khi đủ thời gian, chắt hết nước, rửa qua 3 lần với nước sạch, rồi thấm khô hạt qua giấy thấm nước và đặt hạt vào đĩa Petri nhựa đã được đặt giấy thấm.
- Tiến hành thí nghiệm với mỗi mẫu hạt giống là 400 hạt, nhắc lại 1 lần.