Bảng 4.3. Kết quả đo nồng độ ADN sau khi tách chiết
Chủng Nồng độ (ng/ µl) A260/A280 M14 20,39 1,85 M21 46,99 1,94 M28 62,62 1,83 M31 20,52 1,88 M32 38,88 2,03 M39 53,25 1,86 M43 42,86 1,91 M45 46,68 1,87 M46 69,21 2,05 M47 35,63 2,01 M50 57,32 1,81 M8.1 38,63 2,02
Có thể thấy rằng các mẫu ADN đều có tỷ số A260/280 dao động từ 1,8 đến 2,1 chứng tỏ ADN thu được sạch, không lẫn protein và ARN [5]. Kết quả này cho thấy, các mẫu ADN tổng số thu được theo phương pháp tách chiết này đảm bảo chất lượng.
Các mẫu ADN tổng số được sử dụng làm sợi khuôn cho phản ứng PCR đặc hiệu với cặp mồi đã thiết kế.
4.4.2. Kết quả khuếch đại bằng phản ứng PCR đặc hiệu
Các mẫu ADN tổng số thu được có nồng độ phù hợp sẽ được dùng là khuôn mẫu cho phản ứng PCR với cặp mồi ITS1 và ITS4 sau đó điện di kiểm tra kết quả của phản ứng.
Hình 4.3. Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn ITS
Trên hình 4.3 là kết quả điện di các mẫu đã được tách ADN ở bước trên trong đó: Băng M là băng thang chuẩn ADN có kích thước từ 100 đến 1000 bp băng sáng nhất ở giữa có kích thước 500 bp, các băng được đánh số là các m ẫu sản phẩm PCR trong đó mẫu số 47 và 28 phải chạy lại phản ứng PCR, các mẫu còn lại băng lên rõ ràng không có băng phụ kích thước vào khoảng 640 bp phù hợp với kích thước đoạn
ITS và thích hợp để giải trình tự.
4.4.3. Kết quả giải trình tự
Kết thúc quá trình PCR chúng tôi chọn 7 chủng M14, M21, M31, M43, M45, M46, M50 để giải trình tự trong hình 4.4 và hình 4.5 là kết quả giải trình tự của nấm M 45. Các kết quả khác được liệt kê trong phần phụ lục.
Kết quả giải trình tự cho thấy sản phẩm giải trình tự có chất lương rất tốt, sắc ký đồ rõ ràng. Trình tự ADN của nấm M45 được thể hiện trong hình 4.4
640
bp 500
Hì nh 4.4. T rì nh tự từ n u 33 0 đ ên nu 5 90
Từ kết quả sắc đồ trình tự nucleotide được xuất ra trong hình 4.5
Hình 4.5. Trình tự ADN của nấm M45
Từ kết quả giải trình tự gen của 7 mẫu nấm trên . Chúng tôi so sánh trình tự của đó trên ngân hàng gen, sử dụng phần mềm trực tuyến Blast tại địa chỉ : (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=Blast Search&LINK_LOC=blasthome). Dựa vào mức độ tương đồng giữa chủng phân tích và chủng đã công bố trên ngân hàng gen quốc tế NCBI để định danh.
Trong hình 4.6 là kết quả so sánh chủng M50 với dữ liệu trên ngân hàng gen quốc tế cho thấy chủng FIB PP2.2 là có mức điểm cao nhất( 1022/1022) so với chủng M50 được so sánh, có mức độ bao phủ trình tự phân tích là 100%, và có mức độ tương đồng là 99%. Kết quả này so với kết quả hình thái học trong bảng 4.2 có sự khác biệt, dựa vào hình thái học chủng M50 được phân vào nhóm A.flavus. sự khác nhau này sẽ được bàn luận sâu hơn ở phần kết quả ảnh hiển vi điện tử quét bào tử.
Tiến so sánh tất cả các chủng giải trình tự với dự liệu trên ngân hành gen quốc tế chúng tôi thu được kết quả như trong bảng 4.4