3.2. Phương pháp nghiên cứu
3.2.3. Phương pháp dịnh danh nấm mốc dựa vào trình tự gen ITS
Các khuẩn lạc thu được từ 3.2.2 được giải trình đoạn gen ITS theo quy trình và so sánh với trình tự trên ngân hàng gen quốc tế.
3.2.3.1. Tách chiết ADN tổng số
Các mẫu nấm sau khi được phân lập và làm thuần trên môi trường MEA sẽ được làm nguyên liệu tách chiết ADN tổng số.
Quy trình tách chiết gồm các bước sau :
- Nuôi bào tử qua đêm trên môi trường YEP trong ống eppendorf 1,5ml ở 25±1 ᵒC
- Ly tâm 10000 vòng/ 5 phút, thu sinh khối rửa lại bẳng H20
- Thêm 400µl TES (10 mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8.0, SDS 1%) - Ủ 65◦C, 30 phút
- Thêm cát thạch anh, vortex 1 phút, thu dịch nổi
- Thêm 1 lần thể tích phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25:24:1). Ly tâm ở 4ºC,13000 vòng/ 5 phút thu pha trên
- Lặp lại bước trên , tủa bằng Natri acetate + ethanol 96º ủ đá 10 phút, ly tâm ở 4ºC,14000 vòng/10 phút
- Bỏ dịch thêm 500µl ethanol 70º ly tâm ở 4ºC, 13000 vòng/5 phút - Làm khô 15 phút, thêm 100 µl nước đã khử ion.
Các mẫu ADN tổng số sau đó được kiểm tra chất lượng bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ OD260/280nm để kiểm tra hàm lượng và chất lượng ADN tổng số thu được.
3.2.3.2. Định lượng ADN bằng phương pháp đo độ hấp thu ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260/280nm
Nguyên tắc: Dựa vào khả năng hấp thu ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260nm (A260) của các phân tử ADN. Từ giá trị mật độ quang ở bước sóng 260nm của các mẫu, với hệ số A260 = 1 tương đương với 50µg/ml.
Sử dụng công thức C = A260 x 50 x n (trong đó n là số lần pha loãng) để định lượng ADN trong mẫu tách chiết
3.2.3.3. Khuếch đại bằng phản ứng PCR đặc hiệu
Giai đoạn này nhằm làm tăng số lượng bản sao đoạn ADN đích trên máy luân nhiệt bằng hai mồi đặc hiệu, quá trình khuếch đại được tiến hành trong khoảng 35 chu kỳ
Chuẩn bị ống khuếch đại cho phản ứng 50 µl
Thành phần phản ứng Thể tích (µl)
Master mix 2X 25
ITS1 2
ITS4 2
ADN 2
Tổng thể tích 50
Hút 25 µl master mix 2x chứa enzyme Taq polymerase, cho vào ống nghiệm PCR dung tích 0,2ml thêm vào 2 µl mồi xuôi (ITS1), 2 µl mồi ngược (ITS4), 2 µl mẫu, 19 µl nước không chứa ADNase
Chương trình khuếch đại
Các ống khuếch đại được đặt trong máy luân nhiệt. Chương trình khuếch đại như sau:
Nhiệt độ (ºC) Thời gian Số chu kỳ 96 4 phút 94 45 giây 35 57 1 phút 72 1 phút 20 giây 72 8 phút
Sau khi kết thúc 35 chu kỳ, mẫu được giữ ở nhiệt độ 4oC cho tới lúc điện di.
3.2.3.4. Điện di sản phẩm khuếch đại:
Nguyên lý điện di:
Các phân tử ADN là các polyanion nên trong môi trường trung tính và kiềm, dưới tác dụng cuả điện trường chúng sẽ di chuyển về cực dương. Mức độ di chuyển của các phân tử ADN trong điện trường phụ thuộc chủ yếu vào kích thước ( hay khối lượng phân tử) của chúng. Phân tử có kích thước nhỏ sẽ di chuyển nhanh, còn phân tử có kích thước lớn sẽ di chuyển chậm. Sử dụng thang chuẩn ADN với kích thước đã biết có thể dễ dàng xác định được kích thước tương đối của ADN mẫu.
Chuẩn bị:
Chuẩn bị bản gel: Cân 1g agarose cho vào 100ml TAE 1X sau đó lắc nhẹ lọ để hòa tan agarose. Đun chảy hoàn toàn trong lò vi sóng,bổ sung thuốc nhộm redgel theo tỷ lệ cứ 100ml dung dịch gel cho 5µl, lắc đều để lọ ở nhiệt độ phòng
Khi dung dịch gel nằm trong khoảng 45- 50ºC và đổ vào khay điện di đã có sẵn các lược để tạo giếng. Gel điện di phải có độ dày khoảng 3- 4 mm.
Điện di:
Một giếng trong gel điện di được sử dụng cho thang ADN chuẩn hay mẫu đối chứng dương. Nạp dung dịch điện di ( 1-2 µl loading Dye 6X + 5-6 µl mẫu) đã chuẩn bị vào trong mỗi giếng gel agarose.
Cắm nguồn điện cho máy điện di. Đặt ở hiệu điện thế 110V trong 45 phút. Quan sát, chụp hình
Cho bản gel đã nhuộm vào máy soi UV, đóng kín cửa bảo vệ, bật đèn rồi quan sát các băng phát sáng của ADN xuất hiện trên bản gel. Sau đó chụp hình để lưu trữ kết quả.
Đọc và diễn giải kết quả
Kết quả phân tích được xem xét kết luận khi mẫu đối chứng dương có sản phẩm khuếch đại ADN với kích thước 640 bp và mẫu đối chứng âm không có sản phẩm này. Phản ứng thành công khi có sản phẩm khuếch đại 640 bp trên bản gel
3.2.3.5. Giải trình tự Sanger
Các bước giải trình tự
Bước 1: Làm biến tính sợi khuôn ADN thành 2 sợi đơn và được lai với mồi. Mồi là một sợi đơn gồm vài chục nucleotide có thể liên kêt với một trong hai sợi DNA đơn theo nguyên tắc bắt cặp bổ sung.
Bước 2 : 4 phản ứng riêng rẽ được tiến hành đồng thời. Mỗi phản ứng là hỗn hợp ADN khuôn, mồi, enzyme ADN polymerase, 1 loại dideoxynucleotide và 4 loại deoxynucleotide theo tỷ lệ 1:100
Bước 3: Sản phẩm của 4 phản ứng cùng được phân ly trên gel polyacrylamide cho phép phân biệt hai sợi đơn ADN hơn kém nhau 1 nucleotide.
Các mẫu giải trình tự tiến hành tại công ty 1st BASE Sequencing INT, Hàn Quốc.
Phương pháp xử lý số liệu
Trình tự thô sẽ được xử lý tiếp bằng phần mềm FinchTV để chọn những nucleotide phù hợp cho các sắc đồ. Trình tự nucleotide chuẩn được chuyển lên công cụ BLAST tại ncbi.nlm.nih.gov ( The National Center for Biotechnology Infomation ) so sánh với những loài đã có trình tự ITS đã công bố và định danh chủng theo dựa theo sự tương đồng trên 98%.