Từ kết quả giải trình tự gen của 7 mẫu nấm trên . Chúng tôi so sánh trình tự của đó trên ngân hàng gen, sử dụng phần mềm trực tuyến Blast tại địa chỉ : (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=Blast Search&LINK_LOC=blasthome). Dựa vào mức độ tương đồng giữa chủng phân tích và chủng đã công bố trên ngân hàng gen quốc tế NCBI để định danh.
Trong hình 4.6 là kết quả so sánh chủng M50 với dữ liệu trên ngân hàng gen quốc tế cho thấy chủng FIB PP2.2 là có mức điểm cao nhất( 1022/1022) so với chủng M50 được so sánh, có mức độ bao phủ trình tự phân tích là 100%, và có mức độ tương đồng là 99%. Kết quả này so với kết quả hình thái học trong bảng 4.2 có sự khác biệt, dựa vào hình thái học chủng M50 được phân vào nhóm A.flavus. sự khác nhau này sẽ được bàn luận sâu hơn ở phần kết quả ảnh hiển vi điện tử quét bào tử.
Tiến so sánh tất cả các chủng giải trình tự với dự liệu trên ngân hành gen quốc tế chúng tôi thu được kết quả như trong bảng 4.4
Bảng 4.4. Kết quả tìm kiếm trên ngân hàng gen quốc tế
Mẫu nấm Chủng, trình tự trên ngân hàng gien quốc tế Đoạn ADN so sánh Loài xác định Phần trăm đoạn so sánh % Mức đồng nhất trình tự % M45 MTCC 8654 ITS1, ITS2 Aspergillus flavus 100 100 M50 FIB PP 2.2 ITS1, ITS2 Aspergillus flavus 100 99 M46 KP214054.1 ITS1, ITS2 Aspergillus flavus 100 100 M43 QRF360 ITS1, ITS2 Aspergillus flavus 100 100 M14 Kết quả giải
trình tự xấu
ITS1, ITS2 Không định được loài
M21 Kết quả giải trình tự xấu
ITS1, ITS2 Không định được loài
M31 Kết quả giải trình tự xấu
ITS1, ITS2 Không định được loài
Trong 7 chủng được giải trình tự có 4 chủng được định danh là A. flavus và 3 chủng chưa định danh được do sai lỗi xảy ra. Trong 4 chủng giải trình tự thì có 3 chủng kết quả trùng với kết quả hình thái học.
4.4.4. Kết quả chụp ảnh hiển vi điện tử quét
Để khẳng định sâu hơn về phân loại chúng tôi tiến hành chụp ảnh hiển vi điện tử quét bào tử của hai mẫu M50 và M8.1 tại phòng kính hiển vi - Viện Vệ Sinh Dịch Tễ Trung Ương - 131 Lò Đúc. sau đó so sánh với hình ảnh chuẩn đã được công bố bởi Rodrigues P và cộng sự (2007) trong hình 4.7
Hình 4.7 ảnh hiển vi điện tử quét A.paraciticus (a) và A. flavus( b) và a theo Rodrigues P và cộng sự (2007)
Hình 4.9. Ảnh hiển vi điện tử quét nấm M8.1
So sánh hình 4.8 của mẫu M50 với hình 4.6 cho thấy chủng M50 thuộc
A.flavus với những đặc điểm trên bề mặt bào tử có các thùy dạng như hạt đậu, và rãnh giữa các thùy nông và đều, còn hình 4.8 có những đặc điểm giống với A.paraciticus:
Nhìn hình 4.9 ta thấy hình thái khuẩn lạc của nấm M8.1 hình cầu,xù xì và có gai nhọn thùy chia sâu. Kết hợp của kết quả hình thái và ảnh hiển vi điện tử chúng tôi kết luận nấm M8 là Aspergillus parasiticus.
4.5. Kết quả phân tích khả năng sinh độc tố aflatoxin bằng sắc ký khối phổ
Để bước đầu đánh giá khả năng sinh độc tố aflatoxin của các chủng phân lập được chúng tôi tiến hành với hai chủng M45 và M33.
Mẫu thử được nuôi trên nền mẫu lạc ở điều kiện: 25oC, trong 2 tuần, Và được phân tích bằng kỹ thuật sắc ký khối phổ tại Khoa Độc học dị nguyên - Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia.
Hình 4.7. Sắc đồ chạy sắc ký khối phổ nấm M45
Thời gian lưu của nấm M45 trùng với thời gian lưu của chuẩn, độc tố thuộc nhóm B1 nồng độ aflatoxin B1 của nấm M45 được định lượng là 6,8 ppb, kết quả tương tự với chủng M 33 là aflatoxin B1 với nồng độ 8,60ppb.
Chuẩn AFB1
M45
PHẦN NĂM
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1. Kết luận
1. Xây dựng đươ ̣c phương p háp phân lập và định danh nấm mốc có khả năng sinh đô ̣c tố aflatoxin trong la ̣c bằng phương pháp hình thái ho ̣c kết hợp giải trình tự gen ITS.
2. Phân lập đươ ̣c 30 chủng nghi ngờ Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus trong lạc.
- Khẳng định bằng hình thái ho ̣c 18 chủng là Aspergillus flavus;
- Khẳng định bằng hình thái ho ̣c12chủng là Aspergillus parasiticus;
- Khẳng định đươ ̣c 04 chủng là Aspergillus flavus khi giải trình tự đoạn ITS. 3. Xác định được 02 chủng là Aspergillus flavus sinh đô ̣c tố aflatoxin
B1với nồng độ 6,8 ppb và 8,6 ppb bằng sắc ký khối phổ.
5.2. Kiến nghị
1. Thẩm định phương pháp phân lâ ̣p và đi ̣nh danh nấm Aspergillus flavus và
Aspergillus parasiticus trong nền mẫu la ̣c và mô ̣t số nông sản.
2. Tiếp tục đi ̣nh danh 26 khuẩn la ̣c nghi ngờ còn la ̣i và phân tích khả năng sinh đô ̣c tố aflatoxin.
3. Phân lập và đi ̣nh danh các nấm sinh đô ̣c tố mycotoxin khác trong la ̣c và các nông sản khác.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt
1. Nguyễn Thùy Châu (1996). Nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc và độc tố của chúng trên ngô, gạo Việt Nam và biện pháp phòng trừ, Luận án phó tiến sĩ khoa học sinh học, Trường Đại học Quốc Gia Hà Nội
2. Bùi Xuân Đồng, Nguyễn Huy Văn (2000). Vi nấm dùng trong công nghệ sinh học, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật Hà Nội.
3. Lê Văn Lương, Quyền Đình Thi (2004). Kỹ thuật di truyền và ứng dụng, Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia Hà Nội.
4. Nguyễn Hồng Miên (1980). Nấm mốc độc trong thực phẩm, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật Hà Nội.
5. Quyền Đình Thi (2005). Tập 1: Những kỹ thuật cơ bản trong phân tích DNA, Công nghệ sinh học, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật Hà Nội.
6. Tiêu chuẩn ngành 52 TCN-TQTP 0009:2004. Thường quy kỹ thuật định danh nấm mốc Aspergillus parasiticus, Aspergillus versi-color trong thực phẩm.
7. Tiêu chuẩn ngành 52 TCN-TQTP 0001: 2003. Thường quy kỹ thuật định danh nấm mốc Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus fumigatus trong thực phẩm 8. TCVN 8275-2:2010. Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp định lượng nấm men nấm mốc - Phần 2: Kỹ thuật đếm khuẩn lạc trong các sản phẩm có hoạt độ nước nhỏ hơn hoặc bằng 0.95
9. TCVN 6507-5-2013. Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Chuẩn bị mẫu thử, huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật
10. TCVN 6004- 2008. Vi sinh vật trong thực phẩm và chức năng chăn nuôi. Yêu cầu chung và hướng dẫn kiểm tra vi sinh vật
11. Viện Dinh Dưỡng - Bộ Y tế (2007). Bảng thành phần thực phẩm Việt Nam, Nhà xuất bản Y học, tr.66.
Tài liệu nƣớc ngoài.
12. Eduardo Beltrán., María Ibáñez., Juan Vicente Sancho., Miguel Ángel Cortés., Vicent Yusà., Félix Hernández (2007). “UHPLC–MS/MS highly sensitive
determination of aflatoxins, the aflatoxin metabolite M1 and ochratoxin A in baby food and milk”, Food Chemistry, Issue 2, Pages 737–74.
13. Josep M. Guerrero, Josepa Gene´, Alberto M. Stchigel (1999). Developments in Fungal Taxonomy, Clinical microbiology reviews, p.454-489
14. Anderson H.W., Nehring E.W and Wichser W.R. (1973), “Aflatoxin contamination of Corn in the Field”. Journal of Agriculturre and Food Chemistry, Issue 23, pp. 775-782.
15. Wang J., & Liu X. M. (2006),“Surveillance on contamination of total aflatoxins in corn, peanut, rice, walnut and pine nut in several areas in china”, Chinese Journal of Prevantive Vetrinary Medicine, Issue 4, pp.33-37.
16. Rodrigues P., Soares C., Kozakiewicz Z., Paterson R.R.M., Lima N. and Venâncio N. ( 2007). Identification and characterization of Aspergillus flavus and
aflatoxins, Communicating Current Research and Educational Topics and Trends in Applied Microbiology
17. Virmani S.M (1997), “Risk of aflatoxin contamination of ground nut in Vietnam appreliminary study”, India conference, No CP 1137, pp. 66-78.
18 . Meritxell Ventura, Antonio Gomez, Ivan Anaya, Jordi Diaz, Francesc Broto, Montserrat Agut, Lluis Comellas (2004), “Determination of aflatoxin B1, G1, B2, G2 in medicinal herbs by liquid chromatography – tantandem mass, spectrmetry”, Journal of Chromatography A , Issue 1048, pp. 25-29.
19. Nakai V.K., Rocha de L.O., Goncalez, E., Fonseca H., Ortega E. M. M., & Corrêa B.(2008), “Distribution of fungi and aflatoxins in a stored peanut variety”, Food Chemistry, Issue 106, pp. 285-290.
20. Jiujiang yu., Deepak Bhatnagar., Thomas E. Cleveland. Completed sequence of aflatoxin parthway gene clusted in Aspergilus paraciticus. FEBS Letters 564, 2004 ( 126-130).
Tài liệu Internet
PHỤ LỤC 1. Một số đoạn trình tự nucleotide nấm M43