3.2. Phương pháp nghiên cứu
3.2.4. Xác định khả năng sinh độc tố dựa vào phương pháp sắc ký khối phổ
Các chủng được định danh bằng hình thái học và trình tự ITS xác định khả năntg sinh độc bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC- MS/MS
Hình 3.1. Mô hình hệ thống LC- MS/MS
3.2.4.1. Chiết aflatoxin bằng cột ái lực miễn dịch:
Chuẩn bị mẫu phân tích
Chiết aflatoxin trong mẫu phân tích: Làm sạch trên cột SPE-IM:
Dịch rửa giải được thổi khô đến hết dung môi và hòa cặn chính xác bằng methanol và được bơm vào LC/MS-MS.
3.2.4.2. Chạy sắc ký lỏng khối phổ LC- MS/ MS Điều kiện chạy máy sắc kí lỏng khối phổ
Cột sắc ký pha đảo C18 Dionex hoặc tương đương: 250 mm x 4,6 mm x 5 µm. Pha động:
Sắc kýlỏng Ion hóa Bộ phân tích
khối
Detector/ Lưu giữ số liệu Chân không
Bảng 3.1. Chương trình gradient của pha động
Thời gian (phút) Tỷ lệ % MeOH Tỷ lệ % Amoniacetat 10 mM 0 ─> 4 5 95 4 ─> 5 100 0 5 ─>10 5 95 - Thể tích bơm mẫu: 10 µl. - Tốc độ dòng pha động: 1 ml/phút
- Điều kiện khối phổ: Bảng sau mô tả điều kiện chạy đối với thiết bị MS ABI 5500 QQQ.
Bảng 3.2. Điều kiện chạy khối phổ
Nguồn ion hóa Electrospray (ESI)
Thế ion hóa 4000 KV
Chế độ Ion dương
Nhiệt độ nguồn 300 0C
Khí
Curtain gas: 25 psi Ion source gas 1: 30 psi Ion source gas 2: 10 psi Năng lượng bắn phá CE = 30 eV
Ion chọn lọc B1: 313 ─> 241, CE=41 ─>269, CE=37
Để xác nhận sự có mặt của chất phân tích trên LC-MS/MS, ngoài sự trùng lặp về thời gian lưu tương ứng của mỗi chất còn căn cứ vào tỷ lệ đáp ứng tín hiệu của ion
định lượng và ion định tính. Tỷ lệ này có thể thay đổi tùy thuộc vào độ nhạy của thiết bị.
Với mẫu dương tính, căn cứ vào sự tương quan giữa diện tích pic và nồng độ, căn cứ vào diện tích pic mẫu tính kết quả theo công thức sau
X = V x K x Cm/m
Trong đó: V: Thể tích dịch chiết cuối cùng chạy máy LC-MS/MS (ml) Cm: Nồng độ aflatoxin trong dịch chiết cuối cùng(ng/ml) m: Khối lượng của mẫu phân tích (g)
X: Hàm lượng aflatoxin trong mẫu phân tích (ng/g) K: Hệ số pha loãng
PHẦN THỨ TƢ
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN