2.2.3 .Cấu tạo và nguyên tắc hoạt động của kính hiển vi quang học trường tối
2.3. Quy trình theo dõi đơn hạt nano vàng trong môi trường phức hợp
Theo dõi một hạt duy nhất chuyển động trong dung dịch là một công nghệ theo dõi sự chuyển động của từng phân tử phát quang (huỳnh quang chẳng hạn) dựa trên một hệ ghi ảnh nhanh. Chúng ta lưu lại các quỹ đạo của từng hạt đã được đánh dấu, điều này cho phép nhận được tín hiệu/nhiễu rất tốt và do đó xác định được vị trí của hạt cần theo dõi. Đây là một phương pháp rất mới đang được phát triển để hiện ảnh các quỹ đạo từng phân tử phát
các phân tử có nồng độ lớn. Công nghệ này được đánh giá rất cao trong lĩnh vực nghiên cứu động học các hạt nano vàng trong môi trường phức hợp. Như đã trình bày trong phần trên, kính hiển vi trường tối là ứng viên sáng giá được dùng để quan sát sự tán xạ và hiện ảnh plasmon của hạt nano vàng trong các môi trường phức hợp. Công nghệ theo dõi đơn phân tử là rất lý tưởng cho việc làm bộc lộ các đặc trưng của từng hạt nano sẽ được sử dụng để xác định sự dịch chuyển, hệ số khuếch tán hay vận tốc của nó. Để thuận lợi, chúng tôi ghi một video gồm 1000 ảnh nhờ một camera rất nhạy EM-CCD Andor. Khoảng thời gian giữa 2 ảnh là 0,3s. Quy trình của công nghệ theo dõi đơn hạt thông thường bao gồm 4 bước ( Hình 2.8)
Hình 2.8. Sơ đồ minh họa quy trình theo dõi đơn hạt Bước 1: Ghi một video dưới kính hiển vi trường tối.
Video bao gồm 1000 ảnh và khoảng thời gian giữa 2 ảnh là 0,3s.
Bước 2: Xác định các vị trí tương ứng với mỗi ảnh hiển thị.
Một chuỗi các ảnh được ghi lại bởi camera, sau đó được phân tích bởi phần mềm ImageJ bằng cách sử dụng công cụ plug-in de MOSAIC [24]. Có một số thông số cần được lựa chọn phù hợp để phát hiện ra các hạt, như; radius of particle (pixel) – đây là bán kích của vết sáng trên ảnh chứ không phải bán kính thực của hạt nano; cutoff- số điểm để phân biệt các hạt; percentile- để xác định các điểm ảnh sáng được coi như là hạt. Tất cả các điểm trong
percentile trên của phân bố các cường độ hình ảnh được coi là một hạt. Đơn vị: phần trăm (%).
Để xác định vị trí và theo dõi các đơn hạt trong một video, phần mềm mã nguồn mở ImageJ Plugin đã được sử dụng. Bằng phần mềm này dễ dàng tìm quỹ đạo chuyển động của từng hạt nano theo thời gian. Dưới đây là trình bày tóm tắt cách sử dụng
plugin/Mosaic/Particles Tracker in 2D/3D trong ImageJ: Tải và mở phim trong ImageJ
Một quỹ đạo của hạt được xác định khi liên kết các điểm trong từng ảnh. Trong báo cáo này, chúng tôi xử lý video (phim) có số lượng là 1000 ảnh ứng với khoảng thời gian giữa 2 ảnh là 0,3 giây. Khoảng thời gian giữa các ảnh tiếp theo cũng sẽ tăng dần theo số lượng các ảnh: ∆tn ảnh=0,3 n (số ảnh tiếp theo). Thời gian đó, gọi là thời gian trôi của hạt. Ký hiệu là 𝜏, đơn vị giây (s).
Mở video/File -> Open , ... từ các tập tin.(Hình 2.9 a)
a) b)
Hình 2.9. Mở video theo dõi đơn hạt
Chọn các thông số phát hiện các hạt và xem trước (preview detected)
Lựa chọn Plugins Mosaic Particle Tracker 2D/3D (Hình 2.9b)
Xem kết quả
Nhấp vào Visualize all Trajectories (quan sát tất cả các qũy đạo).
Hình 2.10. Quan sát tất cả các quỹ đạo của các đơn hạt ( khung bên phải được phóng to
để thấy rõ hơn quỹ đạo dịch chuyển của một đơn hạt )
Từ đây chúng ta có thể lấy ra được các thông tin chi tiết cho từng quỹ đạo. Ví dụ dưới đây là hiển thị chi tiết cho quỹ đạo của 1 hạt (trajectory 19) của đơn hạt được quan sát
Hình 2.11. Thông tin quỹ đạo đơn hạt (trajectory 18) xuất ra từ thuật toán của
Hình 2.12.Quỹ đạo chuyển động của 1 đơn hạt theo thời gian .Các tọa độ x và y tạo
thành các điểm ảnh ở mỗi khung hình (frame)cho 1 quỹ đạo của hạt nano
Bước 3: Theo dõi sự dịch chuyển các hạt thông qua việc nối lại các đốm sáng đã được phát hiện.
Từ bảng kết quả này cho ta những thông tin quan trọng để xác định các thông số động học cần khai thác. Trên hình 2.12a chỉ các quỹ đạo tương ứng với mỗi đơn hạt được phát hiện. Hình 2.12b bao gồm các hàng loạt các khung hình của quỹ đạo và chính là tương ứng với các ảnh trong video, nó bắt đầu từ 0-nghĩa là nếu ta chọn trục z dọc theo thứ tự các ảnh thì Frame 0 sẽ là gốc tọa độ (xem hình 2.11). Cột x và y là tọa độ phụ thuộc vào thời gian (t) tương ứng của phân tử (khung hình) tại các ảnh theo hai trục x và y trong mặt phẳng (x,y). Như vậy, ứng với mỗi vị trí (hay mỗi Frame hoặc mỗi ảnh) sẽ xác định được tọa độ x(t) và y(t) (có đơn vị là pixel) của phân tử (trên ảnh là đốm sáng), từ đó dễ dàng tính được bình phương trung bình dịch chuyển theo phương x và phương y. (Hình 2.12 b) thể hiện các tọa độ x và y tạo thành các điểm ảnh ở mỗi khung hình (frame) cho 1 quỹ đạo của một đơn hạt .
Bước này sẽ thực hiện việc liên kết (hay nối) các điểm tương ứng các ảnh với khoảng cách giữa các ảnh theo thời gian (t). Từ đó, xác định được quỹ đạo chuyển động của hạt (hình 2.12 b).
Bước 4: Phân tích kết quả thu được
Từ các bước đã thực hiện ở trên, chúng ta có một cơ sở dữ liệu để phân tích và tính toán các đại lượng cần thiết. Từ đó tính được bình phương trung bình dịch chuyển từ số liệu thực nghiệm trong không gian 2 chiều ( 2 2 2
( ) ( ) ( )
r t x t y t ) theo tất cả các Frame nhờ vào phần mềm matlab (chương trình code được trình bày trong phần phụ lục).Trong đề tài này, tôi đã thực hiện đo đạc và phân tích thống kê trên một số mẫu có tỉ lệ % khác nhau và mỗi tỉ lệ % phân tích hàng chục đơn hạt riêng lẻ. Sau đó kết hợp với lý thuyết (phương trình 1.10) để xác định hệ số khuếch tán , quãng đường dịch chuyển , vận tốc dịch chuyển và bán kính thủy động lực học của từng đơn hạt nano trong các môi trường phức hợp Glycerol-Nước có tỉ lệ khác nhau . Các kết quả thu được sẽ được tôi trình bày và phân tích chi tiết và cụ thể hơn trong chương 3.