Chương 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.3.10.Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.10.Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn
- Bước 1: chuẩn bị nguyên liệu
Nguyên liệu là thân, lá loài Hồng trâu, sau khi thu hái được cắt nhỏ, sau đó đem sấy khô ở nhiệt độ 500C đến khối lượng không đổi.
Nguyên liệu sau khi sấy khô được nghiền chung các bộ phận (thân, lá) của cây trong máy xay đa năng loại nhỏ thành bột dạng mịn. Bột để trong túi bóng kính, bảo quản nơi khô ráo để sử dụng trong các nghiên cứu tiếp theo.
Nguyên liệu được tách chiết theo phương pháp ngâm nóng. Nguyên liệu dạng bột khô được đem đi pha dung môi ethanol ở tỷ lệ 20 gram/100 ml, sau đó cho vào máy lắc với tần số 200 vòng/phút (để các chất có hoạt tính sinh học tan đều trong dung môi) ở các điều kiện thời gian khác nhau (24 giờ, 48 giờ, 72 giờ), sau đó tiến hành lọc qua giấy lọc, 80 ml dịch lọc được đem đi cô đặc bằng máy sấy khô ở nhiệt độ 50 - 70 oC, đến khi có khối lượng khô không đổi và được bảo quản ở 40C để sử dụng trong các nghiên cứu về khả năng kháng khuẩn.
- Bước 3: Chuẩn bị giống vi khuẩn
Thử hoạt tính sinh học với 3 chủng vi sinh vật nhận từ phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học - Vi sinh, khoa Sinh học, Trường Đại học Sư Phạm - Đại học Thái Nguyên.
(1) Lactobacillus plantarum (Gram dương) (2) Bacillus subtilis (Gram dương)
(3) Sarcina lutea (Gram dương)
Môi trường LB được sử dụng để nuôi cấy vi sinh vật kiểm định: (Bảng 2.1)
Bảng 2.2. Thành phần môi trường LB trong 1 lít nước cất
Hóa chất Khối lượng (g/l)
Cao nấm men 5,0
NaCl 5,0
Pepton 5,0
Agar 20,0
Bảo quản giống trên môi trường thạch nghiêng: Vi sinh vật được nuôi hoạt hóa trong môi trường LB, sau đó được cấy chuyển sang môi trường thạch nghiêng, nuôi 24 giờ ở 37ºC, giữ trong tủ lạnh để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo. Cấy chuyển giữ giống trên thạch nghiêng định kỳ 2 tuần một lần. Sau đó, vi khuẩn được nuôi hoạt hóa môi trường LB lỏng, nuôi trong 24 giờ ở nhiệt độ 37ºC để thử hoạt tính kháng khuẩn.
- Bước 4: thử khả năng kháng khuẩn
Kiểm tra khả năng kháng khuẩn của các loại dịch chiết bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch.
Pha cao chiết: Hòa tan cao chiết được lắc trong 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ với dung môi DMS (Dimethyl Sulfoxide) thành các nồng độ theo yêu cầu bảng 2.2.
Bảng 2.3. Nồng độ hòa tan cao chiết với DMS
Lắc trong 24 giờ Lắc trong 48 giờ Lắc trong 72 giờ
Mẫu Nồng độ (g/l) Mẫu Nồng độ (g/l) Mẫu Nồng độ (g/l)
M1 80 M4 80 M7 80
M2 100 M5 100 M8 100
M3 150 M6 150 M9 150
Các thao tác được thực hiện trong tủ cấy vô trùng. Hóa lỏng môi trường LB đặc trong lò vi sóng, đổ đều môi trường vào các đĩa Petri, sau đó để nguội để môi trường đông đặc lại tạo thành mặt phẳng. Dùng micropipet hút 50μl dịch vi khuẩn vào giữa đĩa thạch chứa môi trường LB, dùng que cấy tam giác chang đều cho đến khi mặt thạch khô. Đục 5 giếng trên môi trường thạch với đường kính 7,5 mm, mỗi giếng cách nhau 2 - 3 cm. Mỗi giếng thạch nhỏ 100 μl các dịch chiết. Sử dụng đối chứng là dung môi DMS và nước cất (đã khử trùng). Để các đĩa thạch trong tủ lạnh 4ºC trong 1-2 giờ để dịch chiết khuếch tán ra môi trường nuôi cấy vi khuẩn, sau đó nuôi cấy trong tủ ấm 28-30ºC, sau 24 giờ mang ra đo kích thước vòng vô khuẩn. Hoạt tính kháng khuẩn được xác định bằng cách đo kích thước vòng vô khuẩn (ΔD) bằng công thức:
ΔD = D - d; trong đó: D là đường kính vòng vô khuẩn, d là đường kính giếng thạch.
ΔD ≥ 25 mm: hoạt tính rất mạnh ΔD ≥ 20 mm: hoạt tính mạnh ΔD ≥ 10 mm: hoạt tính trung bình ΔD < 10 mm: hoạt tính yếu