M Ở ĐẦU
2.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Toàn bộ thí nghiệm đƣợc bố trí theo sơ đồ hình 2.1.
Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng thể của nghiên cứu
Nhƣ vậy, đề tài có 3 thí nghiệm chính, mỗi thí nghiệm gồm các nghiệm thức
tƣơng ứng, cụ thể:
Thí nghiệm 1: Khảo sát nồng độ dịch chiết nhau thai heo lên sự tăng sinh tế bào gốc trung mô thu nhận từ mô mỡngười
Thí nghiệm này đƣợc bố trí làm 4 nghiệm thức nhƣ sau:
Nghiệm thức 1 (đối chứng): ATMSCs nuôi trong DMEM bổ sung FBS.
Nghiệm thức 2 (đối chứng dƣơng): ATMSCs nuôi trong DMEM bổ sung FBS
và bFGF.
Nghiệm thức 3: ATMSCs nuôi trong DMEM bổ sung FBS và sử dụng dịch chiết ở nồng độ50 μg/mL
Thu nhận AT-MSCs
cấy chuyền
Nuôi cấy tăng sinh AT- MSCs có bổ sung dịch chiết nồng độ khác nhau
RT-PCR đánh giá biểu hiện gene liên quan lão hóa của AT-MSCs với nồng độ tối ƣu
Tạo mô hình chuột lão hóa da do chiếu UV
Thoa dịch chiết có nồng độ
tối ƣu từ kết quảin vitro
điều trị chuột lão hóa da
Đánh giá hiệu quả dựa vào kết quả nhuộm mô học
Thống kê, phân tích số liệu
Thử nghiệm in vitro Thử nghiệm in vivo
Xác định nồng độ
Nghiệm thức 4: ATMSCs nuôi trong DMEM bổ sung FBS và sử dụng dịch chiết ở nồng độ100 μg/mL
Nghiệm thức 5: ATMSCs nuôi trong DMEM bổ sung FBS và sử dụng dịch chiết ở nồng độ 150 μg/mL
Cơ sở lựa chọn các nồng độ này dựa trên nghiên cứu của Yoshikawa và cộng sựnăm 2013 (Gynecol Obstet 2013, 3:6 DOI: 10.4172/2161-0932.1000186) “Effect
of Porcine Placental Extract on Collagen Production in Human Skin Fibroblasts In
Vitro”, đã áp dụng thang nồng độ các mức từ 0 đến 200 μg/mL và kết quả khảo sát
ở môi trƣờng nuôi cấy có bổ sung nồng độ 200 μg/mL sự tăng sinh tế bào giảm mạnh. Đồng thời, dựa kết quả khảo sát đối với dịch chiết nhau thai cừu và nhau thai bò với các nồng độ khác nhau, chúng tôi chọn 3 nồng độ50 μg/mL, 100 μg/mL và 150 μg/mLđể thực hiện nghiên cứu này.
Thí nghiệm 2: Tạo mô hình chuột lão hoá da dưới tác dụng của UV nhân tạo Cơ sở chọn cường độđèn UV
Chọn đèn UV nhân tạo với công suất đèn 15 W x 2 đèn (UV bƣớc sóng 365
nm), 7 ngày/tuần và thực hiện liên tục trong 8 tuần. Khoảng cách từ đèn đến lƣng
chuột là 30 cm [6]. Cƣờng độ bóng đèn UV đƣợc xác định bằng thiết bị đo cƣờng
độ ánh sáng. Mắc 02 bóng: cƣờng độ đèn đo đƣợc là 0,4 mW/cm2 tƣơng ứng trong một phút là 24 mJ/cm2.
Cơ sở chọn chọn 3 mốc thời gian chiếu UV là 3, 6 và 9 giờ/ngày:
Khoảng thời gian trung bình một ngày có hàm lƣợng tia UV cao nhất thƣờng 3 giờ (vào khung giờ từ 11 giờ trƣa đến 14 giờ chiều). Đây chính là khung thời gian mà những ngƣời làm việc văn phòng thƣờng tiếp xúc với ánh nắng mặt trời.
Khoảng thời gian trung bình một ngày tia UV có khả năng thúc đẩy hiện
tƣợng lão hoá da là 6 giờ. Đây là khoảng thời gian những ngƣời lao động bình
thƣờng tiếp xúc với ánh sáng mặt trời trong ngày;
Số giờ chiếu sáng bởi ánh sáng mặt trời trung bình một ngày khoảng 9 giờ.
Đây là khoảng thời gian những ngƣời lao động những công việc nặng dƣới các công
trƣờng tiếp xúc với ánh sáng mặt trời trong ngày.
Vì vậy, đề tài chọn 3 mốc thời gian chiếu UV là 3, 6 và 9 giờ/ngày và một nghiệm thức đối chứng (không chiếu UV), cụ thể các nghiệm thức lần lƣợt là: đối chứng, 3 giờ, 6 giờ và 9 giờ.
Xây dựng mô hình thí nghiệm 2 bao gồm 4 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 12 chuột:
Nghiệm thức 1 (đối chứng): nuôi trong điều kiện ánh sáng phòng (12 con) Nghiệm thức 2 (3 giờ): chiếu UV 3 giờ/ngày (12 con)
Nghiệm thức 3 (6 giờ): chiếu UV 6 giờ/ ngày (12 con) Nghiệm thức 4 (9 giờ): chiếu UV 9 giờ/ngày (12 con)
Thí nghiệm 3: Khảo sát hiệu quả ngăn ngừa lão hoá da chuột của dịch chiết nhau thai heo.
Cơ sở chọn nồng độ tế bào, tỉ lệ phối trộn, và mốc thời gian chiếu UV: Dựa vào kết quả thí nghiệm 1: chọn ra nồng độ tếbào tăng sinh tối ƣu; dựa trên kết quả
thí nghiệm 2, chọn mốc thời gian chiếu có ảnh hƣởng trong 3 mốc thời gian để thực hiện thí nghiệm 3. Nghĩa là bôi dịch chiết nhau thai heo với nồng độ tăng sinh tế
bào tối ƣu ở thí nghiệm 1 và chiếu UV với mốc thời gian ở thí nghiệm 2, từđó khảo sát hiệu quả của dịch chiết nhau thai heo lên khả năng ngăn ngừa lão hoá da.Thí nghiệm này đƣợc bố trí làm 4 nghiệm thức nhƣ sau:
Nghiệm thức 1 (đối chứng): không bôi dịch chiết nhau thai heo, không chiếu UV
Nghiệm thức 2 (đối chứng âm): chiếu UV, không bôi dịch chiết nhau thai heo Nghiệm thức 3 (đối chứng dƣơng): chiếu UV, bôi sản phẩm thƣơng mại - kem chống lão hoá ban ngày
Nghiệm thức 4 (thí nghiệm): chiếu UV, bôi sản phẩm dịch chiết nhau thai heo.
Cơ sở chọn sản phẩm thương mại:
Pond’slà thƣơng hiệu trực thuộc tập đoàn Unilever chuyên sản xuất hàng tiêu dùng, mỹ phẩm, sức khỏe… lớn nhất thế giới. Các dòng sản phẩm của Pond’s luôn
thuộc nhóm sản phẩm đƣợc ƣa chuộng hàng đầu tại Việt Nam. Sản phẩm kem chống lão hóa ban ngày Pond’s Age Miracle có chỉ số chống nắng SPF 18 PA++, có công dụng giúp kích thích sản sinh Collagen, thúc đẩy quá trình tái tạo da tại tầng biểu bì ngăn ngừa các dấu hiệu lão hóa da, hạn chế các hắc sắc tố gây hại làm da lão hóa. Lựa chọn sản phẩm Pond’s để làm nghiên cứu vì đây là sản phẩm phổ biến trên thị trƣờng hiện nay, có công dụng tƣơng tự yêu cầu của sản phẩm thí nghiệm nhƣ: ngăn ngừa lão hoá, có hiệu quả chống nắng, thúc đẩy tái tạo da, sản sinh collagen.