M Ở ĐẦU
1.6.2. Phƣơng pháp thu nhận dịch chiết nhau thai heo
Thu nhận mẫu nhau thai heo và rửa bằng PSB bổ sung kháng sinh, sau đó nhau thai đƣợc bảo quản trong thùng đá và vận chuyển về phòng thí nghiệm.
Tại phòng thí nghiệm, mẫu nhau thai đƣợc rửa sạch bằng nƣớc cất, sau đó
mẫu sẽđƣợc cắt nhỏtrƣớc khi xay nhuyễn bằng máy xay. Bổsung thêm nƣớc muối sinh lý vào mẫu theo tỷ lệ mẫu:nƣớc muối sinh lý là 1:2 và đƣợc tiến hành thủy phân.
Dung dịch thu đƣợc tiến hành ly tâm 10 000 vòng/phút trong 20 phút ở 4oC. Thu dịch chiết, loại bỏ phần cặn.
Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
- Dòng tế bào gốc trung mô thu nhận từ mô mỡ ngƣời tại Nhật. Dòng tế bào AT-MSCs đƣợc sử dụng trong nghiên cứu đã đƣợc phân lập tại lab Tế bào gốc Đại học Tsukuba Nhật Bản. Dòng ATMSCs đã đƣợc sàng lọc các marker bề mặt đặc
trƣng của tế bào gốc trung mô và khả năng biệt hoá. Dữ liệu dòng tếbào đã đƣợc chuẩn hoá và công bố [34].
- Dịch chiết nhau thai heo đƣợc cung cấp từ phòng thí nghiệm Viện Sinh học nhiệt đới. Dịch chiết đƣợc phân tích kiểm tra thành phần, nồng độ amino acid và kiểm tra hàm lƣợng kim loại nặng đảm bảo hoàn toàn đáp ứng tiêu chuẩn an toàn và
đƣợc sử dụng để tiến hành thí nghiệm. Kết quảđƣợc phân tích bởi Trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm Tp.Hồ Chí Minh (CASE). Dịch chiết nhau thai sau khi kiểm tra nồng độ amino acid đƣợc kiểm tra hàm lƣợng kim loại nặng để đảm bảo không gây ngộ độc tế bào và sức khỏe của con ngƣời (Bảng 3.1, Bảng 3.2). So sánh với Thông tƣ số 06/2011/TT-BYT quy định về Quản lý mỹ phẩm về mức As cho phép trong mỹ phẩm là 5 ppm. Dịch chiết hoàn toàn đáp ứng tiêu chuẩn an toàn, và
đƣợc sử dụng để tiến hành các thí nghiệm.
- Chuột nhắt trắng Mus musculus var. albino 6 - 8 tuần tuổi (18 - 22 gram) do Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh cung cấp.
2.2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
Bảng 2.1. Các thiết bị sử dụng cho thí nghiệm
STT Tên thiết bị Hãng sản xuất Nƣớc sản xuất
1 Tủ cấy vô trùng Sanyo Nhật 2 Tủấm CO2 Sanyo Nhật 3 Máy ly tâm HERMLE Z513K Đức 4 Máy Realtime-PCR IQ5, Biorad Mỹ
5 Buồng đếm hồng cầu Đức
7 Flask 25cm2 Corning Mỹ
8 Đĩa 12 giếng Costar Mỹ
9 Kính hiển vi quang học Olympus Nhật 10 Cân phân tích Shimadzu Nhật 12 Lamen, lamelle Isolab Đức 13 Falcon 50 Kartell Spa Pháp
14 Đĩa petri Steriplan Đan Mạch
15 Chuồng nuôi chuột Việt Nam 16 Pipette Pasteur Volac Anh 17 Pipetman Isolab Đức
18 Chai đựng nƣớc uống chuột Việt Nam
19 Máy cạo lông chuột Philips Đức
20 Đèn chiếu UV 15W Philips Phần Lan
Hoá chất sử dụng cho thí nghiệm:
Formalin 10%, nƣớc cất, nƣớc muối sinh lí, thuốc nhuộm H&E: Hematoxilin và Eosin, các muối KH2PO4 và Na2HPO4.
DMEM (Gibeo), FBS (Atlanta), penicillin, trypsin (Gibeo), PBS, PCRBIO Onestep RT-PCR kit, Cell banker (Nhật), bFGF (Sigma), mồi xuôi, mồi ngƣợc của Col-IV và β-actin.
2.3. THỜI GIAN, ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
Thời gian thực hiện thí nghiệm: từtháng 07/2018 đến tháng 04/2019.
Bố trí mô hình thí nghiệm, thu nhận và phân tích kết quả tại Phòng thí nghiệm Giải phẫu - sinh lí ngƣời và động vật, Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm Thành phố Hồ Chí Minh.
Nhuộm H&E đểđánh giá cấu trúc vi thể của các mẫu da ở các nghiệm thức tại Khoa Giải phẫu bệnh, bệnh viện Quận 2 Tp. HCM.
2.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Toàn bộ thí nghiệm đƣợc bố trí theo sơ đồ hình 2.1.
Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng thể của nghiên cứu
Nhƣ vậy, đề tài có 3 thí nghiệm chính, mỗi thí nghiệm gồm các nghiệm thức
tƣơng ứng, cụ thể:
Thí nghiệm 1: Khảo sát nồng độ dịch chiết nhau thai heo lên sự tăng sinh tế bào gốc trung mô thu nhận từ mô mỡngười
Thí nghiệm này đƣợc bố trí làm 4 nghiệm thức nhƣ sau:
Nghiệm thức 1 (đối chứng): ATMSCs nuôi trong DMEM bổ sung FBS.
Nghiệm thức 2 (đối chứng dƣơng): ATMSCs nuôi trong DMEM bổ sung FBS
và bFGF.
Nghiệm thức 3: ATMSCs nuôi trong DMEM bổ sung FBS và sử dụng dịch chiết ở nồng độ50 μg/mL
Thu nhận AT-MSCs
cấy chuyền
Nuôi cấy tăng sinh AT- MSCs có bổ sung dịch chiết nồng độ khác nhau
RT-PCR đánh giá biểu hiện gene liên quan lão hóa của AT-MSCs với nồng độ tối ƣu
Tạo mô hình chuột lão hóa da do chiếu UV
Thoa dịch chiết có nồng độ
tối ƣu từ kết quảin vitro
điều trị chuột lão hóa da
Đánh giá hiệu quả dựa vào kết quả nhuộm mô học
Thống kê, phân tích số liệu
Thử nghiệm in vitro Thử nghiệm in vivo
Xác định nồng độ
Nghiệm thức 4: ATMSCs nuôi trong DMEM bổ sung FBS và sử dụng dịch chiết ở nồng độ100 μg/mL
Nghiệm thức 5: ATMSCs nuôi trong DMEM bổ sung FBS và sử dụng dịch chiết ở nồng độ 150 μg/mL
Cơ sở lựa chọn các nồng độ này dựa trên nghiên cứu của Yoshikawa và cộng sựnăm 2013 (Gynecol Obstet 2013, 3:6 DOI: 10.4172/2161-0932.1000186) “Effect
of Porcine Placental Extract on Collagen Production in Human Skin Fibroblasts In
Vitro”, đã áp dụng thang nồng độ các mức từ 0 đến 200 μg/mL và kết quả khảo sát
ở môi trƣờng nuôi cấy có bổ sung nồng độ 200 μg/mL sự tăng sinh tế bào giảm mạnh. Đồng thời, dựa kết quả khảo sát đối với dịch chiết nhau thai cừu và nhau thai bò với các nồng độ khác nhau, chúng tôi chọn 3 nồng độ50 μg/mL, 100 μg/mL và 150 μg/mLđể thực hiện nghiên cứu này.
Thí nghiệm 2: Tạo mô hình chuột lão hoá da dưới tác dụng của UV nhân tạo Cơ sở chọn cường độđèn UV
Chọn đèn UV nhân tạo với công suất đèn 15 W x 2 đèn (UV bƣớc sóng 365
nm), 7 ngày/tuần và thực hiện liên tục trong 8 tuần. Khoảng cách từ đèn đến lƣng
chuột là 30 cm [6]. Cƣờng độ bóng đèn UV đƣợc xác định bằng thiết bị đo cƣờng
độ ánh sáng. Mắc 02 bóng: cƣờng độ đèn đo đƣợc là 0,4 mW/cm2 tƣơng ứng trong một phút là 24 mJ/cm2.
Cơ sở chọn chọn 3 mốc thời gian chiếu UV là 3, 6 và 9 giờ/ngày:
Khoảng thời gian trung bình một ngày có hàm lƣợng tia UV cao nhất thƣờng 3 giờ (vào khung giờ từ 11 giờ trƣa đến 14 giờ chiều). Đây chính là khung thời gian mà những ngƣời làm việc văn phòng thƣờng tiếp xúc với ánh nắng mặt trời.
Khoảng thời gian trung bình một ngày tia UV có khả năng thúc đẩy hiện
tƣợng lão hoá da là 6 giờ. Đây là khoảng thời gian những ngƣời lao động bình
thƣờng tiếp xúc với ánh sáng mặt trời trong ngày;
Số giờ chiếu sáng bởi ánh sáng mặt trời trung bình một ngày khoảng 9 giờ.
Đây là khoảng thời gian những ngƣời lao động những công việc nặng dƣới các công
trƣờng tiếp xúc với ánh sáng mặt trời trong ngày.
Vì vậy, đề tài chọn 3 mốc thời gian chiếu UV là 3, 6 và 9 giờ/ngày và một nghiệm thức đối chứng (không chiếu UV), cụ thể các nghiệm thức lần lƣợt là: đối chứng, 3 giờ, 6 giờ và 9 giờ.
Xây dựng mô hình thí nghiệm 2 bao gồm 4 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 12 chuột:
Nghiệm thức 1 (đối chứng): nuôi trong điều kiện ánh sáng phòng (12 con) Nghiệm thức 2 (3 giờ): chiếu UV 3 giờ/ngày (12 con)
Nghiệm thức 3 (6 giờ): chiếu UV 6 giờ/ ngày (12 con) Nghiệm thức 4 (9 giờ): chiếu UV 9 giờ/ngày (12 con)
Thí nghiệm 3: Khảo sát hiệu quả ngăn ngừa lão hoá da chuột của dịch chiết nhau thai heo.
Cơ sở chọn nồng độ tế bào, tỉ lệ phối trộn, và mốc thời gian chiếu UV: Dựa vào kết quả thí nghiệm 1: chọn ra nồng độ tếbào tăng sinh tối ƣu; dựa trên kết quả
thí nghiệm 2, chọn mốc thời gian chiếu có ảnh hƣởng trong 3 mốc thời gian để thực hiện thí nghiệm 3. Nghĩa là bôi dịch chiết nhau thai heo với nồng độ tăng sinh tế
bào tối ƣu ở thí nghiệm 1 và chiếu UV với mốc thời gian ở thí nghiệm 2, từđó khảo sát hiệu quả của dịch chiết nhau thai heo lên khả năng ngăn ngừa lão hoá da.Thí nghiệm này đƣợc bố trí làm 4 nghiệm thức nhƣ sau:
Nghiệm thức 1 (đối chứng): không bôi dịch chiết nhau thai heo, không chiếu UV
Nghiệm thức 2 (đối chứng âm): chiếu UV, không bôi dịch chiết nhau thai heo Nghiệm thức 3 (đối chứng dƣơng): chiếu UV, bôi sản phẩm thƣơng mại - kem chống lão hoá ban ngày
Nghiệm thức 4 (thí nghiệm): chiếu UV, bôi sản phẩm dịch chiết nhau thai heo.
Cơ sở chọn sản phẩm thương mại:
Pond’slà thƣơng hiệu trực thuộc tập đoàn Unilever chuyên sản xuất hàng tiêu dùng, mỹ phẩm, sức khỏe… lớn nhất thế giới. Các dòng sản phẩm của Pond’s luôn
thuộc nhóm sản phẩm đƣợc ƣa chuộng hàng đầu tại Việt Nam. Sản phẩm kem chống lão hóa ban ngày Pond’s Age Miracle có chỉ số chống nắng SPF 18 PA++, có công dụng giúp kích thích sản sinh Collagen, thúc đẩy quá trình tái tạo da tại tầng biểu bì ngăn ngừa các dấu hiệu lão hóa da, hạn chế các hắc sắc tố gây hại làm da lão hóa. Lựa chọn sản phẩm Pond’s để làm nghiên cứu vì đây là sản phẩm phổ biến trên thị trƣờng hiện nay, có công dụng tƣơng tự yêu cầu của sản phẩm thí nghiệm nhƣ: ngăn ngừa lão hoá, có hiệu quả chống nắng, thúc đẩy tái tạo da, sản sinh collagen.
Quy trình cấy chuyền tế bào:
AT-MSCs đƣợc nuôi cấy trong bình flask, khi tế bào phát triển đạt 80 - 90% tiến hành cấy chuyền. Loại bỏ dịch nuôi cấy, rửa tế bào bằng PBS, sau đó bổ sung 1ml trypsin 0,05%, ủ ấm tế bào trong tủấm CO2 từ 3 - 5 phút. Bổ sung thêm 4 ml DMEM bổ sung 10% FBS và 1% penicililin, hút cho vào ống falcon 15 ml tiến hành ly tâm 1500 vòng/phút trong 5 phút. Loại bỏ dịch nổi, tái huyền phù, tiếp tục bổ sung 5 ml DMEM bổ sung 10% FBS và 1% penicililin vào ống và bổ sung thêm
1 μl bFGF. Cho dung dịch vào bình flask, nuôi cấy trong tủ ấm CO2 (CO2 5%, 37oC)
Quy trình bảo quản tế bào
Loại bỏ dịch nuôi cấy, rửa tế bào bằng PBS 2 lần. Bổ sung 1 ml trypsin 0,05%, ủ ấm tế bào trong tủ ấm CO2 từ 3-5 phút. Bổ sung thêm 4 ml DMEM bổ
sung 10% FBS và 1% penicililin, hút cho vào ống falcon 15 ml và tiến hành ly tâm 1500 vòng/phút trong 5 phút. Loại bỏ dịch nổi, bổ sung 1,5 ml cell banker, tái huyền phù; chia vào 3 ống cryotube, mỗi ống 0,5 ml; bảo quản tủ lạnh -80oC.
2.4.2.Khảo sát nồng độ dịch chiết nhau thai heo lên sự tăng sinh tế
bào gốc trung mô thu nhận từ mô mỡngƣời
2.4.2.1. Phương pháp nuôi cấy tế bào:
Cấy chuyền tế bào từ bình flask vào đĩa đƣờng kính 35 mm. Loại bỏ môi
trƣờng nuôi của bình flask, rửa bằng PBS 2 lần, cho vào 1 ml trypsin 0,05%, cho bình flask vào tủ ấm từ 3-5 phút để tế bào bong ra. Bổ sung thêm 4 ml DEM bổ sung 10% FBS và 1% penicililin, tính toán lƣợng tế bào cần thiết bằng cách đếm.
Sau đó, cho dung dịch vào ống falcon 15ml tiến hành ly tâm 1500 vòng/phút trong
5 phút ở 4oC. Loại bỏ dịch nổi, tái huyền phù tế bào sau đó bổ sung thêm 12 ml DMEM bổ sung 10% FBS và 1% penicililin. Mật độ tế bào ban đầu là 4x104 tế bào/đĩa nuôi. Mỗi nghiệm thức thực hiện 3 đĩa để tính giá trị trung bình và sai số. Tếbào đƣợc cấy trong các môi trƣờng nuôi có bổ sung nồng độ dịch chiết lần lƣợt
nhƣ sau: 50 μg/ml, 100 μg/ml, 150μg/ml. Cụ thể:
Nghiệm thức 1 (đối chứng): ATMSCs nuôi trong DMEM bổ sung FBS.
Nghiệm thức 2 (đối chứng dƣơng): ATMSCs nuôi trong DMEM bổ sung FBS
và bFGF.
Nghiệm thức 3: ATMSCs nuôi trong DMEM bổ sung FBS và sử dụng dịch chiết ở nồng độ50 μg/mL
Nghiệm thức 4: ATMSCs nuôi trong DMEM bổ sung FBS và sử dụng dịch chiết ở nồng độ100 μg/mL
Nghiệm thức 5: ATMSCs nuôi trong DMEM bổ sung FBS và sử dụng dịch chiết ở nồng độ150 μg/mL
2.4.2.2. Phương pháp đếm tế bào:
Loại bỏ môi trƣờng ở các giếng sẽ đếm, rửa bằng PBS 2 lần, bổ sung 200 μl
trypsin, cho vào tủ ấm 2 phút để tế bào bong ra. Bổ sung 800 μl DMEM bổ sung 10% FBS và 1% penicililin. Hút ra eppendorf. Mỗi lần đếm lấy 10 μl cho một vi
trƣờng của buồng đếm hồng cầu 0,0025 mm3 (phƣơng pháp đếm bằng buồng đếm tế
bào cải tiến). Tếbào đƣợc đếm trong vòng 10 ngày và ghi nhận kết quả.
2.4.2.3. Phương pháp biệt hóa tế bào
Quy trình biệt hóa của tế bào gốc trung mô thành tế bào mỡ thực hiện như sau:
- Chuẩn bị môi trƣờng biệt hóa tế bào mỡ gồm: DMEM, 0,2mM indomethacin, 50µ axit ascorbic, 0,5µM dexamethasone.
- Khi tế bào đạt 70-80% diện tích đĩa nuôi, cho vào môi trƣờng cảm ứng biệt
hóa, thay môi trƣờng 2 ngày/lần. Theo dõi khảnăng biệt hóa sau 2-3 tuần.
- Đánh giá sự tích tụ các giọt mỡ trong bào tƣơng tế bào khi quan sát dƣới kính hiển vi soi nổi, hoặc nhuộm Oil red O, thấy có sự hiển diện các giọt mỡ trong
bào tƣơng tế bào. Giọt mỡ thƣờng xuất hiện vào ngày 5-7 sau biệt hóa. Qui trình dựa theo tác giả Shahdadfar A (2005).
Các dấu hiệu khẳng định MSC: Sau từ 3-5 ngày nuôi cấy, thu đƣợc quần thể tƣơng đối thuần nhất. Thông thƣờng để khẳng định là MSC dựa vào các tiêu chí sau:
- Hình thái, đặc điểm: các tế bào có hình dạng thoi dài đặc trƣng.
- Về marker bề mặt: biểu hiện dƣơng tính:CD44, CD9, biểu hiện âm tính: CD34, CD14.
Biệt hóa tế bào gốc trung mô thành tạo cốt bào:
Về lý thuyết, các MSC đƣợc biệt hóa trong môi trƣờng có dexamethasone,
ascorbic, β – glycerolphosphatase sẽ biệt hóa thành tạo cốt bào. Sau biệt hóa (biệt
hóa thành công) định danh phát hiện yếu tố tạo xƣơng trong tế bào bằng các kỹ
red, quan sát tinh thểkhoáng dƣới kính hiển vi điện tử quét. Quy trình biệt hóa tiến
hành nhƣ sau:
- Chuẩn bị môi trƣờng biệt hóa: là môi trƣờng biệt hóa xƣơng bổ xung 10mM
β-glycerolphosphat (sigma), 50µg ascorbate (sigma), 10-7 M dexsamethasone (sigma).
- Nuôi cấy tếbào khi đạt mật độ khoảng 10.000/ cm2 trong lớp đơn.
- Đƣa tếbào vào môi trƣờng biệt hóa. Thay môi trƣờng 2-3 ngày/lần.Thời gian biệt hóa từ 14-21 ngày.
Sau biệt hóa 21 ngày, định danh tế bào. Các kỹ thuật định danh tế bào sau biệt hóa: nhuộm Alizarin red, nhuộm hóa mô miễn dịch với marker osteocalcin, kỹ thuật siêu cấu trúc.
2.4.3.Khảo sát sự biểu hiện gene Collagen type IV (Col-IV) của tế bào gốc trung mô gốc trung mô
Xác định sự biểu hiện gene Col-IV của tế bào gốc trung mô trƣớc và sau khi bổ sung dịch chiết nhau thai heo ở nồng độ tối ƣu từ 3 nồng độ khảo sát ở mục 2.4.1.
Trình tự primer của b-actin và Col4. Beta Actin 5’ CACCATTGGCAAGAGCGGTTC 3’ AGGTCTTGCGGATGTCCACGT Col IV 5’ ATGGGGCCCCGGCTCAGC 3’ ATCCTCTTTCACTTTCAATAGC
Phƣơng pháp tiến hành: thí nghiệm tiến hành theo hƣớng dẫn của bộ kit RT- PCR OneStep.
2.4.4. Phƣơng pháp xây dựng mô hình chuột bịảnh hƣởng bởi tia UV
Chuột trắng Mus musculus var. albino cái 4 tuần tuổi (12 - 14 g) đƣợc mua từ
viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh về nuôi ổn định tại Phòng thí nghiệm tại Giải phẫu - sinh lí ngƣời và động vật, Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm Thành phố Hồ Chí Minh 2 tuần đểđạt (19 - 21 g) tƣơng ứng với 6 tuần tuổi.
Chuột 6 tuần tuổi (19 - 21 g) đƣợc chia thành 4 nghiệm thức thí nghiệm, mỗi nghiệm thức có 4 con lặp lại 3 lần (12 con/nghiệm thức), đƣợc nuôi trong 12 chuồng (mỗi chuồng 4 con) đƣợc đánh số thứ tự theo nghiệm thức thí nghiệm và
đánh dấu trên từng con (hình 2.2).
Hình 2.2. Bố trí chuồng nuôi chuột thí nghiệm
(a - đối chứng; b - nghiệm thức 1; c - nghiệm thức 2; d - nghiệm thức 3)
Chuột đƣợc cạo lông vào ngày trƣớc khi tiến hành chiếu đèn. Vị trí cạo lông
đƣợc xác định là một ô chữ nhật thuộc vùng lƣng có kích thƣớc tối thiểu là 9 cm2, vị