M Ở ĐẦU
3.3. KẾT QUẢ KHẢO SÁT HIỆU QUẢ NGĂN NGỪA LÃO HOÁ DA CỦA
3.3.1.Kết quảở mức đại thể
Tƣơng tựnhƣ thí nghiệm 2, trƣớc khi tiến hành chiếu UV để bố trí thí nghiệm 3, đặc điểm da chuột ở các nghiệm thức ban đầu đều đƣợc ghi nhận, kết quả cho thấy da chuột đều có những đặc điểm bên ngoài tƣơng đồng nhau: bề mặt da đồng nhất về cấu trúc, độ đàn hồi tốt, màu da đồng đều, bề mặt da căng, mịn và lông mỏng mịn, dễ cạo sạch lông.
Sau khi chiếu UV, kết quả cho thấy cấu trúc bên ngoài của da ở các nghiệm thức có những thay đổi so với thời điểm trƣớc khi tiến hành thí nghiệm. Sau 4 tuần thí nghiệm, ở nghiệm thức 1 (đối chứng), cấu trúc bên ngoài của da tƣơng đối mịn và vẫn chƣa thể hiện sựthay đổi bên ngoài so với thời điểm trƣớc khi thí nghiệm; ở
nghiệm thức 2 (chiếu UV, không bôi gì cả), da chuột có nếp nhăn rõ ràng hơn so
với thời điểm ban đầu và so với 3 nghiệm thức còn lại. Riêng nghiệm thức 3 và 4, kết quảchƣa thấy sựthay đổi so với thời điểm ban đầu.
Kết thúc 8 tuần chiếu UV, kết quả thể hiện rõ ràng thông qua quan sát tổng thể
bên ngoài (hình 3.12) và mức độ cảm nhận sựđàn hồi của da.
Hình 3.12. Da chuột dƣới ảnh hƣởng của UV và hiệu quảngăn ngừa lão hoá của
các sản phẩm sau 8 tuần chiếu ở các nghiệm thức
- Nghiệm thức đối chứng (không chiếu UV, không bôi bất kì sản phẩm nào): bề mặt da tƣơng đối mịn, có nếp nhăn nhẹ, toàn bộ vùng da có màu tƣơng đối hồng, sự đàn hồi tốt. Phần chân lông mềm, lớp lông mới mọc mềm mịn, dễ cạo và không
để lại chân lông; mọc lông mới khá chậm, mỏng mịn, dễ cạo sạch, không để lại chân lông trên bề mặt da; da có cấu trúc ổn định và rất ít bị tổn thƣơng khi cạo, tốc
độ phục hồi nhanh (hình 3.12 a).
- Nghiệm thức đối chứng âm (chiếu UV 6 giờ/ngày và không bôi bất kì sản phẩm nào): có kết quả tƣơng đồng nhƣ nghiệm thức 3 của thí nghiệm 2: màu da
không đồng nhất, nếp nhăn xuất hiện nhiều, biểu bì bong tróc tạo lớp vảy mỏng trên da, da khô và dễ bị tổn thƣơng, chân lông cứng làm cho da thô ráp, lông mọc có xu
hƣớng cứng hơn so với nghiệm thức đối chứng cùng thời điểm. Sự đàn hồi của da
cũng lâu hơn so với nghiệm thức đối chứng và 2 nghiệm thức còn lại (hình 3.12 b). Kết quảnày cũng cho thấy quy trình chiếu UV với mốc thời gian 6 giờ/ngày liên tục trong 8 tuần và cƣờng độ 24 mJ/cm2 ổn định giữa các lần thí nghiệm (thí nghiệm 2 và thí nghiệm 3).
- Nghiệm thức đối chứng dƣơng (chiếu UV 6 giờ/ngày và bôi sản phẩm
thƣơng mại): màu da không đồng đều, đa phần vùng lƣng bị cạo lông có màu trắng
đục, rất ít vùng có màu da trắng hồng nhƣ nghiệm thức đối chứng. Bề mặt vùng da bị cạo nhẵn, không xuất hiện nếp nhăn. Phần chân lông sau khi cạo trở nên dày và cứng khó thao tác cho các lần tiếp theo, lông ngả màu trắng ngà. Lớp lông mới mọc
thƣờng thô, cứng và khó cắt tỉa hơn so với lông của chuột đối chứng và nghiệm thức sản phẩm thí nghiệm khi quan sát cùng thời điểm (hình 3.12 c).
- Nghiệm thức sản phẩm thí nghiệm (chiếu UV 6 giờ/ngày và bôi dịch chiết nhau thai heo): bề mặt da nhẵn, mịn màng, không có nếp nhăn, toàn bộ vùng da có màu trắng hồng, sự đàn hồi tốt. Phần chân lông mềm, lớp lông mới mọc mềm mịn, dễ cạo và không để lại chân lông; mọc lông mới khá chậm, mỏng mịn, dễ cạo sạch,
không để lại chân lông trên bề mặt da; da có cấu trúc ổn định và rất ít bị tổn thƣơng
khi cạo, tốc độ phục hồi nhanh (hình 3.12 d). Nhìn tổng thể, da chuột ở nghiệm thức này mịn và hồng hơn so với cả nghiệm thức đối chứng, không có hiện tƣợng bị
trắng dục trên da nhƣ ở nghiệm thức bôi sản phẩm thƣơng mại.
Nhƣ vậy, kết quả thí nghiệm cho thấy sau 8 tuần thí nghiệm, xét về mức đại thể, dịch chiết nhau thai heo đã thể hiện đƣợc hiệu quả ngăn ngừa lão hoá da chuột do tia UV gây ra.
3.3.2.Kết quảở mức vi thể
3.3.2.1. Độ dày biểu bì
Hiệu quảngăn ngừa lão hoá của dịch chiết nhau thai heo dựa trên kết quả khảo sát độ dày biểu bì chuột sau 8 tuần thí nghiệm ở mức vi thể (hình 3.13) có độ dày biểu bì đƣợc thể hiện ở biểu đồ hình 3.14.
Hình 3.13. Kết quảđộ dày biểu bì da chuột sau 8 tuần thí nghiệm ở các nghiệm thức (X40)
Hình 3.14. Biểu đồ thể hiện độ dày biểu bì da chuột ở các nghiệm thức khảo sát
Từ biểu đồ hình 3.14 nhận thấy, độ dày biểu bì của chuột bị có sựthay đổi rõ rệt giữa các nghiệm thức (xem phụ lục 3.3). Cụ thể:
Ở nghiệm thức đối chứng (không chiếu UV 6 giờ/ngày, không bôi bất kì sản phẩm nào), độ dày trung bình của biểu bì là 14,53 µm, kết quả này cũng tƣơng đƣơng với nghiệm thức đối chứng của thí nghiệm 2 (14,53 µm so với 14,5 µm, p > 0,05); ở nghiệm thức đối chứng âm (chiếu UV 6 giờ/ngày, không bôi bất kì sản phẩm nào), độ dày trung bình của biểu bì có sựtăng lên rõ rệt và có sự cách biệt với
độ tin cậy rất cao (p < 0,001) đến 23,40 µm. Kết quả này phù hợp với kết quả của thí nghiệm tạo mô hình chuột lão hoá tại mục 3.2 (24,06 µm). Kết quả ở nghiệm thức đối chứng và đối chứng âm cho thấy mô hình thí nghiệm bốtrí trong đề tài này
tƣơng đối ổn định giữa các thí nghiệm. Theo đó, các kết quả của các nghiệm thức bôi sản phẩm sẽ có độ tin cậy cao khi cùng đƣợc thực hiện trong một điều kiện
tƣơng đối ổn định nhƣ vậy.
Ở nghiệm thức đối chứng dƣơng (chiếu UV 6 giờ/ngày, bôi sản phẩm thƣơng
mại với công dụng ngăn ngừa lão hoá da) có độ dày trung bình biểu bì là 17,55 µm. Kết quả này cũng tƣơng đƣơng với nghiệm thức 2 ( chiếu UV 6 giờ/ngày) của thí nghiệm 2. Nhƣ vậy, khi bôi sản phẩm thƣơng mại làm cho biểu bì da chuột có tăng
so với khi không bôi và không chiếu UV tới 3,02 µm (p < 0,01); đồng thời giúp cho biểu bì da chuột giảm hẳn so với nghiệm thức đối chứng âm tới 5,85 µm (p < 0,01).
Từ kết quả này cho thấy hiệu quả ngăn ngừa lão hoá của sản phẩm thƣơng mại đã
thể hiện một cách rõ rệt: biểu bì da chuột không dày lên đáng khi bịtác động bởi tia UV.
Ở nghiệm thức bôi sản phẩm thí nghiệm (chiếu UV 6 giờ/ngày, bôi dịch chiết nhau thai heo nồng độ 100µg/ml), kết quả thu đƣợc độ dày trung bình biểu bì là 17,52 µm, kết quả này tƣơng đƣơng với nghiệm thức đối chứng dƣơng là 17,55 µm (p > 0,05). Nhƣ vậy, sản phẩm dịch chiết nhau thai heo trong thí nghiệm này đã thể
hiện đƣợc tính hiệu quả trong việc ngăn ngừa lão hoá da chuột thông qua độ dày biểu bì tƣơng đƣơng với sản phẩm thƣơng mại dùng làm đối chứng dƣơng. Tuy nhiên, đây chỉ mới là một tiêu chí của hiện tƣợng lão hoá da chuột nói riêng và lão hoá da nói chung.
3.3.2.2. Cấu trúc Collagen
Sau khi nhuộm HE, mẫu da đƣợc quan sát dƣới kính hiển vi và đánh giá cấu trúc collagen dựa trên 4 mức độ lão hoá nhƣ hình 3.10, kết quả hình ảnh cũng đƣợc thể hiện ở hình 3.15.
Hình 3.15. Cấu trúc Collagen ở các mức độ lão hoá trong thí nghiệm 3 (X40)
Số lƣợng mẫu bị lão hoá da dựa theo cấu trúc collagen ở các nghiệm thức
Hình 3.16. Biểu đồ thể hiện sốlƣợng mẫu bị lão hoá da dựa theo cấu trúc collagen
ở các nghiệm thức khảo sát
Từ kết quả số lƣợng mẫu ở từng mức độ lão hoá (xem phụ lục 3.4), quy đổi thành tỉ lệ (%) mức độ lão hoá ở các nghiệm thức khảo sát theo phƣơng pháp mô tả ở mục 2.4.6, kết quảđƣợc thể hiện qua bảng 3.4.
Bảng 3.4. Tỉ lệ (%) mức độ lão hoá da chuột ở các nghiệm thức khảo sát Nghiệm thức Lão hoá
mức 0 Lão hoá mức 1 Lão hoá mức 2 Lão hoá mức 3 Đối chứng 56,67% 43,33% 00% 00% Đối chứng (-) 6,67% 36,67% 30,00% 26,67% Đối chứng (+) 53,33% 46,67% 00% 00% Sản phẩm thí nghiệm
(dịch chiết nhau thai heo nồng
độ 100 μg/ml)
Từ kết quả biểu đồ hình 3.16 và bảng 3.4, kết quả đánh giá hiệu quả ngăn
ngừa lão hoá da của dịch chiết nhau thai heo thông qua cấu trúc collagen đƣợc mô tả tóm tắt nhƣ sau:
- Ở nghiệm thức đối chứng (không chiếu UV và không bôi sản phẩm thực nghiệm): trong điều kiện ánh sáng trắng của phòng thí nghiệm (12 giờ sáng :12 giờ
tối), sau 8 tuần thí nghiệm, kết quả cho thấy khá tƣơng đồng với kết quả của nghiệm thức đối chứng ở thí nghiệm 2: chỉ có 56,67% không bị lão hoá da (mức 0), và vẫn có tới 43,33% chuột có dấu hiệu lão hoá da (mức 1). Điều này có nghĩa là trong
điều kiện nuôi bình thƣờng, quá trình lão hoá nội tại vẫn diễn ra theo chu trình sống tự nhiên của chuột và chỉ lão hoá ở mức 1(chiếm 43,3%), không có các mức khác với độ lão hoá nặng hơn (mức 2 và mức 3). Bên cạnh đó, kết quả nhuộm HE cho thấy xuất hiện một số đứt gãy trong cấu trúc collagen và mật độ collagen bắt đầu không liên tục (hình 3.16 a). Nhƣ vậy, chuột khi đƣợc nuôi trong điều kiện bình
thƣờng và đạt 14 tuần tuổi sẽ có sựlão hoá do thay đổi cấu trúc collagen với một tỉ
lệ nhất định và chƣa tới 50%. Ngoài ra, sựtƣơng đồng với kết quảđối chứng của thí nghiệm 2 cũng cho thấy tính ổn định của thí nghiệm đƣợc kiểm soát, tạo độ tin cậy cao trong việc đánh giá các các nghiệm thức cần khảo sát.
- Ở nghiệm thức đối chứng âm (chiếu UV 6 giờ/ngày và không bôi bất kì sản phẩm nào), mức độlão hoá thay đổi rõ rệt so với ở nghiệm thức đối chứng và phù hợp với kết quả nghiên cứu tạo mô hình chuột lão hoá da ở mục 3.2: sốlƣợng mẫu không bị lão hoá da (mức 0) chỉ có 6,67%; số lƣợng mẫu có dấu hiệu lão hoá da (mức 1) chiếm 36,67%; bị lão hoá da (mức 2) chiếm 30% và đặc biệt, có tới 26,67% mẫu da bị lão hoá nặng (mức 3). Nhƣ vậy, với thời gian chiếu 6 giờ/ngày và không bôi bất kì sản phẩm nào, chuột bị lão hoá da rõ rệt. Sự xuất hiện lão hoá mức 2 và mức 3 một lần nữa có thể khẳng định rằng, việc chiếu tia UV có ảnh hƣởng đến cấu trúc collagen và làm biến đổi cấu trúc này, gây ra hiện tƣợng đứt gãy và mất sự liên kết giữa các sợi collagen với nhau và kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu tạo mô hình chuột lão hoá da ở mục 3.2.
- Đối với nghiệm thức đối chứng dƣơng (chiếu UV 6 giờ/ngày và bôi sản phẩm thƣơng mại với công dụng ngăn ngừa lão hoá da), kết quả thực nghiệm cho thấy có 53,33% chuột không bị lão hoá da và có 46,67% chuột bắt đầu có dấu hiệu lão hoá da (mức 1), chƣa thấy mẫu nào có hiện tƣợng lão hoá da nhiều (mức 2, mức 3). Mặc dù tỉ lệ phần trăm lão hoá ở mức 1 có cao hơn so với nghiệm thức đối chứng nhƣng tỉ lệ không đáng kể (46,47% so với 43,33%, p > 0,05, tƣơng ứng).
dƣới tác dụng của UV một cách đáng kể thông qua cấu trúc collagen: không còn lão hoá ở mức 2 và 3, mức 1 trở vềtƣơng đƣơng với điều kiện nuôi bình thƣờng.
- Đối với nghiệm thức bôi sản phẩm thí nghiệm (chiếu UV 6 giờ/ngày và bôi dịch chiết nhau thai heo): có phân nửa không bị lão hoá và phân nửa lão hoá mức 1. So với nghiệm thức bôi sản phẩm thƣơng mại, dù số lƣợng mẫu không lão hoá da thấp hơn 3,33% và số lƣợng mẫu lão hoá mức 1 cao hơn 3,33% (50% so với 53,33%; 50% so với 46,67%, tƣơng ứng) nhƣng kết quả đang tiệm cận về với kết quả bôi sản phẩm thƣơng mại cũng nhƣ kết quả nuôi trong điều kiện bình thƣờng (không có UV). Ngoài ra, kết quả của nghiệm thức này cũng cho thấy không xuất hiện hiện hiện tƣợng lão hoá da ở mức 2, mức 3. Nhƣ vậy, sản phẩm thì nghiệm
cũng đã thể hiện đƣợc hiệu quả ngăn ngừa lão hoá da chuột dƣới tác động của tia UV gần với sản phẩm thƣơng mại. Điều này cho thấy sản phẩm ứng viên có tiềm
năng trong việc ngăn ngừa lão hoá da chuột dƣới tác động của tia UV thông qua sự thay đổi cấu trúc collagen.
Tóm lại, từ kết quả phân tích trên có thể nhận định: dịch chiết nhau thai heo có bƣớc đầu thể hiện đƣợc hiệu quảngăn ngừa lão hoá da chuột dƣới tác động của UV. Cần có các nghiên cứu ở mức chuyên sâu đểđủcơ sở khoa học khẳng định vai trò hữu hiệu của dịch chiết nhau thai heo trong việc ngăn ngừa lão hoá da dƣới tác dụng của UV.
3.3.3.Biện luận:
Hiệu quả ngăn ngừa lão hóa da của dịch chiết nhau thai heo: Nhau thai heo có bFGF (yếu tốtăng trƣởng nguyên bào sợi cơ bản) đây yếu tốtăng trƣởng quan trọng để tếbào tăng sinh. Đồng thời, bFGF còn liên quan tới một sốcon đƣờng tín hiệu khác nhƣ PI3K-AKT, STAT. bFGF có vai trò quan trọng trong các mô
trƣởng thành, vì nhân tố này có thểđiều hoà chức năng trao đổi chất, sữa chửa tổn
thƣơng mô, tái tạo mô và sự sống sót của tế bào [36].
Dựa trên kết quả thành phần acid amin của dịch chiết nhau thai heo đƣợc phân tích bởi Trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm Tp.Hồ Chí Minh (CASE) (Bảng 3.1) có thể thấy với thành phần 15 acid amin có tổng nồng độ là 482,34 mg/100ml đây chính là nguồn dƣỡng chất phong phú kích thích cho sựtăng sinh tế
bào, đồng nghĩa với việc tái tạo da, thúc đẩy quá trình sản sinh collagen dƣới da. Ngoài ra, sản phẩm dịch chiết nhau thai heo đƣợc dùng với dạng gel, quá trình thí nghiệm đã bôi lại sau 3 giờ chiếu tia UV, vì dạng gel có công dụng nhƣ lớp màng giữẩm cho da trên da lâu hơn, giúp hạn chế khô da do tiếp xúc thời gian dài
dƣới tia UV. Điều này giải thích lý do vì sao khi quan sát đại thể da chuột sử dụng sản phẩm thực nghiệm có hiện tƣợng ẩm, mịn rõ rệt hơn so với da chuột bôi sản phẩm thƣơng mại, mặc dù khi so sánh 2 tiêu chí độ dày biểu bì và cấu trúc collagen thì kết quảtƣơng đƣơng nhau.
Tóm lại, sản phẩm dịch chiết nhau thai heo có nồng độ100 µg/ml bƣớc đầu có hiệu quảđáp ứng các tiêu chí ngăn ngừa lão hoá da.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. KẾT LUẬN
Kết quả nghiên cứu thu đƣợc cho phép rút ra các kết luận sau:
- Trong 3 nồng độ khảo sát, dịch chiết nhau thai heo với nồng độ 100 µg/mL giúp sự tăng sinh tếbào đạt tối ƣu về số lƣợng tế bào và thời gian tăng sinh, có sự tăng sinh nhẹ về biểu hiện gene Col-IV của ATMSCs.
- Tia UV với cƣờng độ 24 mJ/cm2 chiếu liên tục 7 ngày trong tuần và sau 8 tuần thí nghiệm đã tác động lên lên da chuột: mức độ lão hoá da bên ngoài (da khô, nếp nhăn nhiều, sựđàn hồi giảm dần), độ dày biểu bì và cấu trúc collagen bịđứt gãy và mức độ lão hoá da có xu hƣớng tăng dần theo sựtăng dần thời gian chiếu (3 giờ, 6 giờ, và 9 giờ chiếu), trong đó nghiệm thức 6 giờ và 9 giờ cho kết quả chƣa cách
biệt về mặt thống kê vềđộ dày biểu bì (24,06 và 25,87 µm, tƣơng ứng, p > 0,05). - Dịch chiết nhau thai heo với nồng độ 100 µg/mL bƣớc đầu cho thấy đã có
hiệu quả trong việc ngăn ngừa lão hoá da chuột dƣới tác động của tia UV (24 mJ/cm2, chiếu 6 giờ/ngày) sau 8 tuần thí nghiệm tƣơng đƣơng với sản phẩm thƣơng