M Ở ĐẦU
3.2. KẾT QUẢ TẠO MÔ HÌNH CHUỘT LÃO HOÁ DA BỞI TIA UV
3.2.1. Ảnh hƣởng ở mức đại thể
Trƣớc khi tiến hành chiếu UV để bố trí thí nghiệm, đặc điểm da chuột ở các nghiệm thức ban đầu đều có những đặc điểm bên ngoài tƣơng đồng nhau: bề mặt da
đồng nhất về cấu trúc, độđàn hồi tốt, màu da đồng đều, bề mặt da căng, mịn và lông mỏng mịn, dễ cạo sạch lông (hình 3.6).
Hình 3.6. Chuột đƣợc cạo lông trƣớc khi chiếu UV
Sau khi chiếu UV, kết quả cho thấy cấu trúc bên ngoài của da ở các nghiệm thức thí nghiệm có những thay đổi so với thời điểm trƣớc khi thí nghiệm, đặc biệt là mốc thời gian bắt đầu từ tuần thứ 4 (sau 4 tuần chiếu). Ở nghiệm thức đối chứng (không chiếu UV): hình dạng và cấu trúc bên ngoài của da không thấy có sự thay
đổi so với thời điểm trƣớc khi chiếu UV. Ở nghiệm thức 1 (chiếu UV 3 giờ) và 2 (chiếu UV 6 giờ) chƣa thấy có đặc điểm gì khác biệt so với nghiệm thức đối chứng. Riêng ở nghiệm thức 3 (chiếu UV 9 giờ) có sự xuất hiện các nếp nhăn nông và lớp biểu bì bong tróc ở một số chuột, chân lông cứng hơn, sựđàn hồi của da lâu hơn so với nghiệm thức đối chứng.
Kết thúc thí nghiệm (sau 8 tuần chiếu UV), kết quả thể hiện rõ ràng thông qua quan sát tổng thể bên ngoài (hình 3.7) và mức độ cảm nhận sựđàn hồi của da.
Hình 3.7. Da chuột dƣới ảnh hƣởng của UV sau 8 tuần chiếu ở các nghiệm thức
(a - đối chứng; b - 3 giờ; c - 6 giờ; d - 9 giờ)
Nghiệm thức đối chứng: bề mặt da nhẵn, mịn, không có nếp nhăn, toàn bộ
vùng da có màu trắng hồng, sự đàn hồi tốt. Phần chân lông mềm, lớp lông mới mọc mềm mịn, dễ cạo và không để lại chân lông; mọc lông mới khá chậm, mỏng mịn, dễ
cạo sạch, không để lại chân lông trên bề mặt da; da có cấu trúc ổn định và rất ít bị
tổn thƣơng khi cạo, tốc độ phục hồi nhanh (hình 3.7 a).
Nghiệm thức 1 (chiếu UV 3 giờ/ngày): bề mặt da tƣơng đối nhẵn, có dấu hiệu khác biệt so với chuột ở nghiệm thức đối chứng; một số chuột xuất hiện nếp nhăn
nông và khó nhận biết, khi chuột di chuyển có xuất hiện một số nếp nhăn nông nhƣng nhanh chóng trở lại trạng thái bình thƣờng, màu da trắng hồng và đều, sựđàn
hồi tốt, rất ít tế bào bị bong tróc, tốc độ phục hồi nhanh, khá tƣơng đồng so với chuột đối chứng. Phần chân lông mềm, lớp lông mới mọc mềm mịn, dễ cạo và
không để lại chân lông (hình 3.7 b).
Nghiệm thức 2 (6 giờ/ngày): màu da không đồng nhất, nhiều khu vực có màu trắng đục, bề mặt da xuất hiện khá nhiều nếp nhăn nông, khi chuột di chuyển các nếp nhăn trởnên sâu hơn và dễ nhận thấy bằng mắt thƣờng. Biểu bì bị bong tróc và tạo nên một lớp vảy mỏng màu trắng trên bề mặt da. Da khô và dễ bị tổn thƣơng,
phần chân lông sau khi cạo trở nên cứng và tạo thành một lớp màu trắng đục, thô ráp trên bề mặt da. Lông mới mọc có xu hƣớng cứng và chắc hơn so với chuột ở
nghiệm thức đối chứng và nghiệm thức 1 ở cùng thời điểm quan sát. Sựđàn hồi của da giảm (lâu hơn) so với nghiệm thức đối chứng và nghiệm thức 1, da mất một khoảng thời gian để phục hồi trạng thái ban đầu và có thể quan sát bằng mắt thƣờng (hình 3.7 c).
Nghiệm thức 3 (9 giờ/ngày): da khô rõ, biểu bì bong tróc, bề mặt da thô ráp và dễ tổn thƣơng, màu da không đồng đều, đa phần vùng lƣng bị cạo lông có màu trắng đục, rất ít vùng có màu da trắng hồng nhƣ nghiệm thức đối chứng. Bề mặt vùng da bị cạo xuất hiện các nếp nhăn sâu và nhiều hơn so với chuột ở nghiệm thức 2 và nếp nhăn trởnên sâu và rõ hơn khi chuột di chuyển. So với nghiệm thức 2, khả năng đàn hồi của da kém, chạm tay vào có cảm giác da nhão và phải mất nhiều thời
gian hơn để trở lại trạng thái ban đầu. Phần chân lông sau khi cạo trở nên dày và cứng khó thao tác cho các lần tiếp theo. Lớp lông mới mọc thƣờng thô, cứng và khó cắt tỉa hơn so với lông của chuột đối chứng và nghiệm thức 1, 2 quan sát cùng thời
3.2.2. Ảnh hƣởng cấu trúc vi thể của da
3.2.2.1. Độ dày biểu bì
Hình 3.8. Ảnh hƣởng của UV lên độ dày biểu bì chuột sau 8 tuần thí nghiệm (X40)
(a - đối chứng; b - 3 giờ; c - 6 giờ; d - 9 giờ)
Ảnh hƣởng của UV lên độ dày biểu bì chuột sau 8 tuần thí nghiệm ở mức vi thể
Hình 3.9. Biểu đồ thể hiện độ dày biểu bì dƣới tác động của UV sau 8 tuần chiếu
Từ biểu đồ hình 3.9 nhận thấy, độ dày biểu bì của chuột bị ảnh hƣởng rõ rệt
dƣới tác dụng của các mốc thời gian chiếu UV. Cụ thể:
Ở nghiệm thức đối chứng (không chiếu UV), độ dày trung bình của biểu bì là 14,50 µm, độ dày biểu bì ở các nghiệm thức còn lại (1, 2 và 3) đều tăng lên và có sự
cách biệt với độ tin cậy rất cao (p < 0,001) (xem phụ lục 3.1). Khi chiếu UV liên tục 3 giờ/ngày, độ dày biểu bì trung bình khoảng 18,17 µm (tăng 3,66 µm so với nghiệm thức đối chứng); chiếu liên tục 6 giờ/ngày, độ dày biểu bì khoảng 24,06 µm
(tăng gấp gần 1,7 lần so với nghiệm thức đối chứng) và ở mốc chiếu 9 giờ/ngày biểu bì có độ dày lớn nhất, trung bình khoảng 25,87 µm (tăng gấp gần 1,8 lần so với nghiệm thức đối chứng). Tóm lại, độ dày biểu bì tăng dần theo ngƣỡng thời gian chiếu UV. Điều này có thểdo cơ chế tự bảo vệ của da để chống lại sức nóng của tia UV. Tốc độ tăng không theo tuyến tính, nguyên nhân có thể do sự kích thích tác
động từ mức UV càng cao có thể làm cho độ dày càng tăng để chống lại sức nóng từ
tia UV, nhƣng khi đến ngƣỡng thì sựgia tăng này sẽ chậm lại và đƣợc duy trì.
3.2.2.2. Cấu trúc collagen
Sau khi nhuộm HE, mẫu da đƣợc quan sát dƣới kính hiển vi nhận thấy cấu trúc collagen với 4 mức độ khác nhau một cách rõ rệt (hình 3.10).
Hình 3.10. Cấu trúc collagen ở các mức độ lão hoá dƣới tác động của UV (X40)
Số lƣợng mẫu bị lão hoá da dựa theo cấu trúc collagen dƣới ảnh hƣởng của thời gian chiếu tia UV đƣợc thể hiện qua biểu đồ hình 3.11.
Hình 3.11. Biểu đồ thể hiện sốlƣợng mẫu bị lão hoá da dựa theo cấu trúc collagen
dƣới tác động của UV
Từ kết quả số lƣợng mẫu ở từng mức độ lão hoá (xem phụ lục 3.2), quy đổi thành tỉ lệ (%) mức độ lão hoá dƣới ảnh hƣởng của cƣờng độ chiếu ở mỗi nghiệm thức theo phƣơng pháp ở mục 2.4.4, kết quảđƣợc thể hiện qua bảng 3.3.
Bảng 3.3. Tỉ lệ (%) mức độ lão hoá da dƣới ảnh hƣởng của mốc thời gian chiếu Nghiệm thức Lão hoá
mức 0 Lão hoá mức 1 Lão hoá mức 2 Lão hoá mức 3 Đối chứng 60,00% 40,00% 0,00% 0,00% Nghiệm thức 1 33,00% 47,00% 20,00% 0,00% Nghiệm thức 2 6,70% 33,30% 33,30% 26,70% Nghiệm thức 3 3,30% 20,00% 50,00% 26,70%
Từ kết quả biểu đồ hình 3.11 và bảng 3.3, kết quảđánh giá mức độ lão hoá ở
Ở nghiệm thức đối chứng (không chiếu UV): trong điều kiện ánh sáng trắng của phòng thí nghiệm (12 giờ sáng :12 giờ tối), sau 8 tuần chỉ có 60% không bị lão hoá da (mức 0), và vẫn có tới 40% chuột có dấu hiệu lão hoá da (mức 1). Nhƣ vậy,
trong điều kiện nuôi bình thƣờng, quá trình lão hoá nội tại vẫn diễn ra theo chu trình sống tự nhiên của chuột (chiếm 40%). Kết quả nhuộm HE cho thấy xuất hiện một số đứt gãy trong cấu trúc collagen và mật độ collagen bắt đầu không liên tục. Tuy nhiên, ở nghiệm thức này không có lão hoá da mức 2 và 3; lão hoá mức 1 vẫn dƣới 50%. Kết quả này cho thấy chuột đƣợc nuôi trong điều kiện bình thƣờng, khi đạt 14 tuần tuổi, sự lão hoá do thay đổi cấu trúc collagen là không đáng kể. Điều này giúp cho sựđánh giá ảnh hƣởng của tia UV lên tốc độ lão hoá có tính tin cậy cao.
Ở nghiệm thức 1 (chiếu UV 3 giờ/ngày), kết quả thực nghiệm cho thấy có 33% chuột không bị lão hoá da, trong khi đó có tới 47% chuột bắt đầu có dấu hiệu lão hoá da (mức 1) và 20% chuột bị lão hoá da (mức 2), chƣa thấy mẫu nào có hiện
tƣợng lão hoá da nhiều (mức 3). Sự xuất hiện lão hoá mức 2 ở thời gian chiếu UV 3 giờ/ngày có thể khẳng định rằng, việc chiếu tia UV có ảnh hƣởng đến cấu trúc collagen và làm biến đổi cấu trúc này, gây ra hiện tƣợng đứt gãy và mất sự liên kết giữa các sợi collagen với nhau.
Ở nghiệm thức 2 (chiếu UV 6 giờ/ngày), mức độ lão hoá thay đổi rõ rệt so với
ở nghiệm thức chiếu 3 giờ/ngày: sốlƣợng mẫu không bị lão hoá da (mức 0) chỉ có 6,7%; sốlƣợng mẫu có dấu hiệu lão hoá da (mức 1 và mức 2) bằng nhau, đều chiếm 33,33% và đặc biệt, có tới 26,7% mẫu da bị lão hoá nặng (mức 3). Nhƣ vậy, với thời gian chiếu 6 giờ/ngày, chuột bị lão hoá da tăng so với khi chiếu 3 giờ/ngày (33,33% so 20%, tƣơng ứng); sự xuất hiện lão hoá da nặng với tỉ lệ 26,7% chứng tỏ
thời gian tiếp xúc với tia UV lâu hơn đã gây ra hiện tƣợng đứt gãy hầu hết cấu trúc collagen ở nhiều mức độ khác nhau. Trong khi đó, với thời gian chiếu 3 giờ/ngày
chƣa ghi nhận đƣợc hiện tƣợng lão hoá da nặng (mức 3).
Ở nghiệm thức 3 (chiếu 9 UV giờ/ngày), sốlƣợng mẫu không lão hoá da chỉ
chiếm một tỉ lệ rất nhỏ (3,30%), trong khi các mức độ lão hoá da (mức 1 và 2) có những biến đổi so với khi chiếu UV 6 giờ/ngày, cụ thể: số lƣợng mẫu có dấu hiệu lão hoá da giảm (20% so với 33,3%), số lƣợng mẫu bị lão hoá da tăng gấp 1,5 lần (50% so với 33,3%). Riêng hiện tƣợng lão hoá da mức độ nặng ở nghiệm thức này
không thay đổi so với nghiệm thức chiếu UV 6 giờ/ngày (đều 26,7%). Qua đó có
thể thấy, mặc dù với lƣợng thời gian chiếu UV dài hơn (9 giờ/ngày) nhƣng vẫn chƣa
tạo sự cách biệt về mức độ lão hoá da nặng so với thời gian chiếu 6 giờ/ngày. Trong
khác nhau tƣơng đối hợp lí. Vì vậy, xét về hiệu quả thí nghiệm và phƣơng diện kinh tế, môi trƣờng, tính hợp lí về khung thời gian thực tế, đề tài chọn thời gian chiếu UV 6 giờ/ngày để tiếp tục khảo sát hiệu quả ngăn ngừa lão hoá da chuột của dịch chiết nhau thai heo ở thí nghiệm 3..
Tóm lại, từ kết quả phân tích trên có thể nhận định: cùng một cƣờng độ (24 mJ/cm2), sự tổn thƣơng lên da chuột có xu hƣớng tăng dần theo sự tăng dần thời gian chiếu (3 giờ, 6 giờ, và 9 giờ chiếu): tăng mức độ lão hoá da bên ngoài (da khô, nếp nhăn nhiều, sự đàn hồi của da giảm dần); độ dày biểu bì sau 6 và 9 giờ chiếu
tƣơng đƣơng nhau nhƣng tăng cách biệt so với 3 giờ và 0 giờ chiếu; cấu trúc collagen bị đứt gãy tăng dần; mức độ lão hoá da cũng tăng dần.
3.2.3.Biện luận
Sự tăng độ dày biểu bì do tác động của tia UV: Độ dày biểu bì da chuột tăng khi tăng thời gian chiếu UV trong ngày: 3 giờ, 6 giờ và 9 giờ chiếu UV. Kết quả này khá tƣơng đồng với công bố của các nghiên cứu: của Yoon Jung Kim và cộng sự(2015), độ dày biểu bì ở da chuột có chiếu UV lớn hơn so với nhóm chuột không
đƣợc chiếu UV (p < 0,001); của Lan Wang và cộng sự (2016), độ dày trung bình của biểu bì chuột ở nhóm chiếu UV tăng gấp 4,63 lần so với nhóm không chiếu UV, (15,62 µm) [38]; của Tapan K. Bhattacharyya và cộng sự (2017): độ dày biểu bì ở
nhóm chuột đƣợc chiếu UV lớn hơn so với nhóm không chiếu UV (17,7 so với 9,4 µm, p < 0,01) [5]. Độ dày biểu bì da chuột tăng sau khi chiếu UV có thểđƣợc giải
thích nhƣ sau: khi tiếp xúc với tiaUV làm cho da tăng độ dày của lớp sừng, đồng thời lớp biểu bì bị sừng hoá quá mức, đây chính là cơ chế để bảo vệ da [6]; sự
quang hoá gây ra bởi tia UV là một quá trình tích lũy chất oxy hoá, cơ chếtƣơng tự nhƣ là lão hoá nội tại [39]. Ngoài ra, việc tiếp xúc với tia UV gây ảnh hƣởng đến những thay đổi bên trong cấu trúc da. Đặc biệt, khi da tiếp xúc với UV trong thời gian dài sẽ gây tổn thƣơng DNA, tăng stress oxy hoá, từ đó gây sản sinh ra nhiều gốc oxy hoá tự do (ROS - Reactive oxygen species). Chính điều này làm cho sự sản sinh collagen giảm, tăng cƣờng tổng hợp và hoạt động của maxtrix metallicoprotease (MMP) – chịu trách nhiệm về suy thoái mô liên kết, tích lũy các
tế bào bạch cầu, tổng hợp và tích lũy các kiểu hình liên quan đến lão hoá và giảm sự đàn hồi của da. Tất cả những yếu tố này làm xuất hiện nếp nhăn ởda và tăng độ dày biểu bì ở da [40]. Mặt khác, sựtăng độ dày biểu bì da còn là do khi da tiếp xúc với tia UV gây ra phản ứng tế bào phức tạp, chủ yếu là qua trung gian sản xuất ROS.
Theo đó, khi có sựgia tăng các phản ứng oxy hoá, yếu tốtăng trƣởng tế bào keratin - một thành phần của yếu tố tăng trƣởng nguyên bào sợi, thúc đẩy tăng trƣởng và
biệt hoá biểu mô và tham gia vào sự sống của tế bào sau chấn thƣơng oxy hoá sẽ tăng hoạt động [41]. chính yếu tố tăng trƣởng này sẽ làm gia tăng lƣợng tế bào
keratin để chống tia UV trên các tế bào biểu bì da [42, 43]. Đồng thời, sự gia tăng
quá trình phân chia tế bào keratin sau khi tiếp xúc với tia UV cũng dẫn đến sự tích tụ của tế bào keratin, từđó làm tăng độ dày biểu bì.
Tóm lại, sựgia tăng mức độ tiếp xúc với tia UV (tăng thời gian chiếu) dẫn đến sự tăng độ dày biểu bì, sự gia tăng này phù hợp với đặc điểm sinh lí của chuột để
chống lại với tác hại của tia UV nhằm giúp bảo vệ da và cấu trúc dƣới da, chống lại quá trình lão hoá. Tuy nhiên, khi tiếp xúc với tia UV quá lâu sẽ gây tổn thƣơng da
và thậm chí gây ung thƣ da.
Sự thay đổi cấu trúc collagen do ảnh hưởng của tia UV: Sự tiếp xúc của da với tia UV dẫn đến sự phá hủy cấu trúc collagen và tăng mức độ lão hoá da. Sựđứt gãy cấu trúc collagen và mức độ lão hoá da gia tăng khi tăng thời gian tiếp xúc với tia UV.. Kết quả này tƣơng đồng với nghiên cứu của Yoon Jung Kim và cộng sự (2015): tính đa dạng và mật độ của sợi collagen giảm đáng kể ở vùng hạ bì của da ở
nhóm chuột bị chiếu UV so với nhóm chuột không chiếu UV (p < 0,01). Nhóm này cho rằng, các MMP đƣợc tiết ra quá mức từ các tế bào keratinocytes bị kích thích bởi tác động của tia UV, các nguyên bào sợi và các tế bào viêm góp phần làm suy giảm ma trận ngoại bào ở da bị chiếu UV [44-46]. Collagenase MMP-1 và MMP-3
đóng một vai trò quan trọng trong việc khởi đầu sự thoái hoá của collagens loại I, III và IV - đây là các thành phần chính của lớp hạ bì ở da [47]. Bên cạnh đó,
Gelatinase MMP-9 đóng vai trò chính trong sự thoái hoá cuối cùng của collagen
cũng bị phân cắt thành gelatin và các peptide nhỏ, một yếu tố chính chịu trách nhiệm hình thành nếp nhăn [39, 48, 49].
Theo Lan Wang và cộng sự (2016), sau thời gian dài chiếu UV, hàm lƣợng collagen ở nhóm có chiếu UV giảm rõ rệt so với nhóm đối chứng (p < 0,05). Trong lớp hạ bì của da bị quang hoá, các bó sợi collagen bị rối và bị phá hủy đi kèm với các sợi đàn hồi bị suy giảm nghiêm trọng. Theo đó, cơ chế chính của những thay
đổi mô học bất thƣờng này là sự sản xuất quá mức của MMP, chẳng hạn nhƣ MMP- 1 và MMP-3. MMP-1 phá vỡ các sợi collagenvà elastin, trong khi MMP-3 làm suy giảm các sợi đàn hồi và các thành phần liên kết khác, do đó, làm mất khảnăng đàn
hồi của da [50]. MMP gia tăng quá mức là kết quả của sựtích lũy các ROS và phản
ứng viêm. Cơ chế bảo vệ chống lại tác hại của ROS là hệ thống phòng thủ chống oxy hoá [51]. Enzyme chống oxy hoá nội tại có thể làm sạch ROS và bảo vệ các tế