5. Những đóng góp của luận văn:
1.4. ĐỘC TÍNH BÁN TRƢỜNG DIỄN
1.4.1. Khái quát độc tính bán trƣờng diễn
Độc tính bán trƣờng diễn đƣợc định nghĩa là sự phát triển của các tác dụng phụ là kết quả của việc tiếp xúc lâu dài với chất gây ô nhiễm hoặc tác
nhân gây căng thẳng khác, là một khía cạnh quan trọng của độc tính thủy sinh.
Các tác động bất lợi liên quan đến độc tính bán trƣờng diễn có thể gây chết
ngƣời trực tiếp nhƣng phổ biến hơn là giảm dần, bao gồm cả những thay đổi vềsinh trƣởng, sinh sản hoặc hành vị Độc tính bán trƣờng diễn trái ngƣợc với
độc tính cấp tính, xảy ra trong một khoảng thời gian ngắn hơn với nồng độ cao hơn. Các xét nghiệm độc tính khác nhau có thể đƣợc thực hiện để đánh
giá độc tính bán trƣờng diễn của các chất gây ô nhiễm khác nhau và thƣờng kéo dài ít nhất 10% tuổi thọ của một sinh vật. Nói cách khác, độc tính bán
trƣờng diễn là sự phát triển của các tác dụng phụ do hậu quả của việc tiếp xúc lâu dài với chất độc hoặc tác nhân gây căng thẳng khác. Nó có thể biểu hiện
dƣới dạng gây chết ngƣời trực tiếp nhƣng phổ biến hơn là đề cập đến các
điểm cuối dƣới mức nhƣ tăng trƣởng giảm, sinh sản giảm hoặc thay đổi hành
vi nhƣ hiệu suất bơi bị ảnh hƣởng.
1.4.2. Tính bền vững trong môi trƣờng của độc chất
Các quá trình hữu sinh và vô sinh tồn tại trong tự nhiên thực hiện chức năng loại thải độc tố hóa học. Nhiều hóa chất thải vào môi trƣờng có tính nguy hại thấp do chúng có thời gian sống thấp. Các hóa chất có mối nguy hại cao
(ĐT: Dichloro-Diphenyl-Trichloroethane, PCB: Polychlorinated biphenyl,
TCĐ: Polychlorinated dibenzodioxin) không bị phân hủy và bền vững lâu dài trong môi trƣờng. Việc tiếp tục thải các chất này vào trong môi trƣờng sẽ dẫn đến sự tích lũy của chúng đến mức độ đủ để gây độc. Những hóa chất này có thể tiếp tục gây độc trong thời gian dài cho dù quá trình thải chúng vào môi trƣờng đã dừng lại từ lâụ Chúng ta có thể đánh giá sự bền vững của các hóa chất qua thời gian bán hủy hủy của chúng. Sự phân hủy của độc chất trong môi trƣờng thƣờng diễn ra qua 2 quá trình: hữu sinh và vô sinh. Cả hai quá trình hữu sinh và vô sinh đều có vai trò quan trọng trong việc phân hủy và chuyển hóa các độc chất trong môi trƣờng.
1.4.3. Đặc tính của quá trình tích lũy sinh học
Chỉ có tính chất bền vững trong môi trƣờng, thì các chất sẽ không gây nên vấn đề gì cho môi trƣờng. Nếu một chất không thể xâm nhập vào bên trong cơ thể của sinh vật, thì nó sẽ không đem đến mối đe dọa nàọ Một khi đã đƣợc hấp thu, hóa chất đƣợc tích lũy trong cơ thể đến giới hạn có thể gây độc. Sự tích lũy sinh học đƣợc định nghĩa nhƣ là một quá trình mà qua đó sinh vật tích lũy các hóa chất trực tiếp từ môi trƣờng vô sinh (nƣớc, khí, đất) và từ các nguồn thức ăn (truyền dƣỡng). Các hóa chất môi trƣờng đƣợc hấp thu một lƣợng lớn bởi sinh vật qua quá trình khuếch tán thụ động. Vị trí đầu tiên cho việc hấp thu bao gồm màng phổi, mang, đƣờng ruột. Da và các cấu trúc khác (vảy, lông mao, lông vũ) có tác dụng bảo vệ cơ thể. Tuy nhiên, việc hấp thu một số hóa chất qua da có thể xảy rạ Các hóa chất phải xuyên qua lớp
đôi lipid của màng để đi vào trong cơ thể. Tiềm năng tích lũy sinh học các hóa chất có liên quan với sự hòa tan trong lipid của các chất. Môi trƣờng nƣớc là nơi mà tại đó các chất có ái lực với lipid xuyên qua tấm chắn giữa môi trƣờng vô sinh và sinh vật. Bởi vì sông, hồ và đại dƣơng nhƣ là các bể lắng các chất và sinh vật thủy sinh chuyển một lƣợng lớn nƣớc xuyên qua màng hô hấp của chúng (mang) cho phép tách một lƣợng vừa đủ các hóa chất từ nƣớc. Thủy sinh vật có thể tích lũy sinh học các hóa chất có ái lực với lipid và đạt đến nồng độ cao hơn nồng độ chất đó có trong môi trƣờng.
Sự hấp thu các chất hòa tan trong lipid từ môi trƣờng phụ thuộc chủ yếu vào thành phần lipid của các cơ quan, bởi vì lipid của cơ thế là nơi đầu tiên lƣu lại hóa chất. Các hóa chất có thể đƣợc chuyển vào chuỗi thức ăn từ sinh vật đến động vật ăn thịt. Đối với các chất hòa tan trong lipid, thì sự vận chuyển này có thể dẫn đến việc tăng nồng độ hóa chất với mỗi mắc xích tiếp
theo trong chuỗi thức ăn (phát tán sinh học). Điều đó cho thấy tích lũy sinh học độc chất điển hình từ nƣớc môi trƣờng nƣớc hơn là từ thức ăn và dƣờng nhƣ không có một cá thể nào tích lũy độc chất ở cùng một mức độ từ cả 2 nguồn. Ví dụ, sự vận chuyển ĐT trong chuỗi thức ăn đã dẫn đến sự suy thoái nhiều quần thể chim ăn thịt. Điều này đã góp phần làm nên một quyết định là cấm sử dụng chất diệt côn trùng nàỵ Tích lũy sinh học làm chậm quá trình biểu hiện độc tính của hóa chất. Lúc đầu độc chất đƣợc tích lũy trong
lipid, nhƣng vẫn di chuyển đến mục tiêụ Khi lipid đƣợc sử dụng thì hóa chất này mới biểu hiện độc tính. Ví dụ, độc chất tích lũy trong lipid thƣờng đƣợc di chuyển trong quá trình chuẩn bị cho sự sinh sản. Sự mất lipid có thể dẫn đến giải phóng các độc chất hòa tan trong lipid và làm cho chúng trở nên độc. Hệ quả này có thể dẫn đến sự chết của các cá thể trƣởng thành khi chúng tiến đến sự thành thục để sinh sản. Các hóa chất hòa tan trong lipid cũng có thể đƣợc chuyển cho các thế hệ saụ Ví dụ, lipid có trong lòng đỏ của trứng hoặc trong sữa động vật có vú, có khả năng sự gây độc cho các thế hệ sau mà thế hệ bố mẹ không bị nhiễm độc bởi các hóa chất nàỵ
Về lý thuyết, điều quan trọng là có thể thấy tất cả các chất gây nên độc tính cấp ở một nồng độ đủ cao, thì hầu nhƣ không gây nên độc tính bán
1.4.4. Thử nghiệm về độc tính bán trƣờng diễn
Để đánh giá sự an toàn của sản phẩm lên men, chế phẩm bột sinh khối nấm Thƣợng Hoàng đƣợc thử nghiệm độc tính bán trƣờng diễn theo các tiêu
chí nhƣ lựa chọn mô hình thử (căn cứ vào các thông tin của mẫu thử và kết quả thử độc tính cấp để thiết kế mô hình, mức liều thử), thời gian thử, liều dùng và theo dõi, đánh giá. Động vật đƣợc chọn để thử độc tính bán trƣờng diễn thuộc các loài gậm nhấm, hoặc không gậm nhấm, chú ý giống, cân nặng, tuổi sinh trƣởng... Trong điều kiện thực tế hiện nay, chuột hay thỏ đƣợc dùng phổ biến cho các thử nghiệm bán trƣờng diễn. Số động vật tối thiểu đƣợc dùng là 8 (4 đực, 4 cái). Số lƣợng tƣơng đối là 10 - 12 để có thể tính đƣợc độ tin cậỵ Trọng lƣợng tùy theo loàị Động vật thực nghiệm đƣợc chia thành 3
lô:
- Lô chứng dùng dung môi pha thuốc.
- Lô trị 1 dùng thuốc thử với liều tƣơng đƣơng liều dùng trên ngƣờị
- Lô trị 2 dùng thuốc thử với liều gấp 3-5 lần liều dùng trên ngƣờị
Thời gian thực nghiệm tuỳ thuộc vào thời gian thuốc đƣợc sử dụng trên lâm sàng. Nói chung thời gian dùng thuốc trong thực nghiệm gấp 2 -3 lần thời gian dùng thuốc trên lâm sàng, và cho thuốc hàng ngàỵThời gian tối thiểu thử
độc tính bán trƣờng diễn là 1 tháng. Thuốc đƣợc dùng chủ yếu qua đƣờng
uống bằng dụng cụ chuyên biệt. Liều thử nghiệm đƣợc tính từ liều dƣới liều tối đa an toàn của chuột, thỏ hoặc tính từ liều thƣờng dùng trên ngƣờị Thể tích thuốc cho thỏ uống mỗi lần là 5- 10 ml, tiêm 3 ml. Các chỉ tiêu quan sát thông thƣờng là:
- Về máu: số lƣợng hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, công thức bạch cầu, tỷ lệ huyết sắc tố, thể tích trung bình hồng cầụ
- Về chức năng gan: enzym AST, ALT, bilirubin toàn phần, albumin và cholesterol toàn phần.
- Về chức năng thận : creatinin huyết thanh.
Kiểm tra 1 lần trƣớc khi cho thuốc, ít nhất một lần trong khi dùng thuốc và một lần trƣớc khi giết động vật.
- Phân: hình thái rắn, nhão, ỉa chảy ….
- Lƣợng thức ăn tiêu thụ và thể trạng chung, trọng lƣợng, lông, hoạt động của động vật.
Xét nghiệm về tổ chức học (đại thể và vi thể) của động vật phải đƣợc tiến hành mỗi khi có động vật chết trong quá trình nghiên cứu và ở 30% động vật bị giết chết sau khi kết thúc đợt thử nghiệm.
Nhƣ vậy, chế phẩm bột sinh khối nấm Thƣợng Hoàng đƣợc thử nghiệm
Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
2.1.1. Vật liệu nghiên cứu
- Giống nấm Thƣợng hoàng đƣợc cung cấp bởi Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Giống nấm Thƣợng hoàng
Phellinus linteus chủng GC đƣợc lựa chọn để lên men thu sinh khối do có sản
lƣợng cao hơn trong số các chủng nghiên cứu và có khả năng sinh enzym
ngoại bào tốt hơn. Các hóa chất đƣợc mua đạt chuẩn dùng cho vi sinh vật,
mua của các hãng nhƣ Sigma aldrich, Việt Nam, Trung Quốc, Nhật Bản và
một số hãng khác. Các vật tƣ tiêu hao sử dụng trong nghiên cứu đƣợc mua ở
các công ty nhập khẩu hóa chất trong nƣớc. - Môi trƣờng phân lập và nhân giống:
Môi trƣờng sử dụng để phân lập và nhân giống là môi trƣờng thạch khoai tây (PDA) bao gồm các thành phần nhƣ sau: Khoai tây: 200-300 g, gọt vỏ rửa sạch và cắt nhỏ. Đun với nƣớc trong 20 phút sau đó chắt lấy nƣớc trong. Cao nấm men: 1 g/l; Glucose: 20 g/l; Agar: 15 g/l. Trộn tất cả các thành phần và đƣa về thể tích 1 lít. Khử trùng ở 121oC trong 15 phút, khi môi
trƣờng nguội bớt thì đổđĩa thạch.
- Môi trƣờng lên men chìm: Môi trƣờng lỏng ban đầu có thể dùng môi
trƣờng khoai tây lỏng (PD), các thành phần gồm nhƣ đối với môi trƣờng thạch, ngoại trừ không bổ sung thạch agar.
- Môi trƣờng lên men lỏng cho các thí nghiệm tiếp theo gồm: Môi trƣờng lỏng ban đầu đƣợc chuẩn bị dựa trên tham khảo của Lee và cộng sự [8]. Cụ thể ở bảng 2.1.
Bảng 2. 1: Thành phần môi trƣờng lên men lỏng
Thành phần Hàm lƣợng (g/l) Nguồn cacbon 40g/l Nguồn nitơ 20g/l K2HPO4 0,46g/l KH2PO4 1,00 g/l MgSO4.7H2O 0,5g/l MnCl2.4H2O 0,036g/l
ZnCl2 0,03 g/l
FeCl2 0,01g/l
CuSO4.7H2O 0,005g/l
Trộn tất cả các thành phần và đƣa về thể tích 1 lít. Khử trùng ở 121oC
trong 15 phút, khi môi trƣờng nguội thì có thể cấy giống. Tùy thuộc vào một số quy mô và thiết bị, có thể bổ sung chất phá bọt ở nồng độ 50 ppm khi tiến
hành lên men để hạn chế sự tạo bọt bên trong thiết bị.
- Môi trƣờng tối ƣu (MTTƢ) đã nghiên cứu trên bình tam giác 250ml bao gồm các thành phần trong bảng 2.1, pH=6,0, Khử trùng ở 121oC, áp suất 1 atm trong 20 phút.
Bảng 2. 2: Thành phần môi trƣờng tối ƣu (MTTƢ)
Thành phần Hàm lƣợng (g/l) Glucose 40g/l Cao nấm men 20g/l K2HPO4 0,46g/l KH2PO4 1g/l MgSO4.7H2O 0,5g/l MnCl2 0,036g/l ZnCl2 0,03 g/l FeCl2 0,01g/l CuSO4.7H2O 0,005g/l Nƣớc cấtvừa đủ 1l
- Môi trƣờng bổ sung đã nghiên cứu trên bình tam giác 250ml bao gồm các thành phần trong bảng 2.2, pH=6,0, Khử trùng ở 121oC, áp suất 1 atm trong 20 phút. Bảng 2. 3: Thành phần môi trƣờng bổ sung Thành phần Hàm lƣợng (g/l) Glucose 30g/l Cao nấm men 15g/l Tinh bột gạo lứt đỏ 30 g/L K2HPO4 0,46g/l KH2PO4 1g/l
MgSO4.7H2O 0,5g/l MnCl2.4H2O 0,036g/l ZnCl2 0,03 g/l FeCl2 0,01g/l CuSO4 0,005g/l Nƣớc cấtvừa đủ 1l
Động vật thí nghiệm: Thỏ Newzealand trƣởng thành cả hai giống đực và cái, khỏe mạnh, thỏ cái không mang thai hoặc cho con bú, chƣa trải qua bất kỳ thử nghiệm nào trƣớc đó, cân nặng khoảng 1,8 –2,2 kg. Có nguồn gốc từ bộ phận chăn nuôi – Khoa Dƣợc lý – Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung
Ƣơng. Thỏ đƣợc nuôi mỗi con một lồng trong phòng nuôi có kiểm soát nhiệt
độvà độ ẩm thích hợp với thức ăn và nƣớc uống theo nhu cầụ Tất cả các thao
tác trên động vật thí nghiệm đều đƣợc tuân theo các quy trình về chăm sóc và
sử dụng động vật thí nghiệm của Khoa Dƣợc lý – Viện Kiểm nghiệm thuốc
Trung Ƣơng.
2.1.2. Máy móc thiết bị
- Cân kỹ thuật của hãng JJ223BC, Trung Quốc. - Cân phân tích của hãng OHAUS, Trung Quốc. - Tủ cấy vi sinhcủa Việt Nam.
- Máy lắc ổn nhiệt.
- Nồi khử trùngcủa hãng Hirayama/Nhật Bản. - Nồi lên mencủa hãng Mitecom-Việt Nam. - Máy vắt ly tâmcủa Việt Nam.
- Tủ lạnh 4oC của hãng Sharp – Thái lan. - Tủ lạnh 200C của hãng Sanakỵ
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phƣơng pháp nhân giống nấm, cấy chuyển giống nấm và lên men men
Chủng Phellinus linteus đƣợc làm thuần trên đĩa thạch. Nuôi cấy liên tục và duy trì trên môi trƣờng thạch khoai tây glucosẹ Nuôi cấy lỏng sợi nấm
đƣợc bắt đầu bằng cách chuyển sợi nấm từ nuôi cấy trên đĩa petri vào môi
trƣờng nuôi cấy tối ƣu lỏng. Tiến hành nhân giống các cấp trên môi trƣờng tối
ƣụ Sau đó thực hiện lên men từ bình tam giác đến bình lên men 100 lít chứa
65 lít môi trƣờng. Điều kiện lên men đƣợc điều chỉnh ở nhiệt độ từ 27oC đến 28oC. Tốc độ xục khí là 1 lít khí/lít dung dịch/phút. Tốc độ khuấy từ 100 đến
200 vòng, tùy theo giai đoạn của sợi nấm phát triển và độ bền của máy, nhằm
đảm bảo sinh khối phát triển tốt, không vón cục và bảo toàn trục khuấy của máỵ
* Nhân giống nấm và cấy chuyển giống nấm
Để có thể nhân giống trên môi trƣờng thạch thì cần chuẩn bị môi trƣờng thạch khoai tây theo công thức phía trên (Khoai tây 200 g/L, Glucose 20 g/L, Agar 20 g/L, nƣớc 1000 ml). Tiến hành hấp khử trùng môi trƣờng ở nhiệt độ 121oC trong vòng 30 phút để môi trƣờng trở thành vô trùng. Cần chuẩn bị trƣớc các đĩa petri đã khử trùng, bật đèn tím trƣớc để diệt khuẩn tủ cấỵ Lấy môi trƣờng ra khỏi nồi hấp, cho vào tủ cấy và để nguộị Thao tác đổ đĩa thạch cần đều tay, mỗi đĩa petri có khoảng 20ml môi trƣờng thạch, chờ đĩa thạch đông nguội thì úp ngƣợc đĩạ Khi đã có các đĩa môi trƣờng thạch, chủng nấm PL đƣợc cắt miếng kích thƣớc khoảng 1cm2từ đĩa thạch giống và cấy tại điểm chính giữa đĩa thạch, bọc kín và nuôi trong tủ ở điều kiện nhiệt độ 28oC. Khi đã có đƣợc các đĩa thạch chứa chủng nấm PL thì tiến hành chuẩn bị MTTƢ để tiến hành nhân giống trong môi trƣờng lỏng. MTTƢ đƣợc pha theo công thức đã đƣợc nêu, cho vào các bình tam giác 250ml mỗi bình chứa 100ml, tiến hành hấp khử trùng với điều kiện nhƣ đã làm với môi trƣờng thạch khoai tâỵ Trƣớc khi cấy thì cần cho giống và các bình môi trƣờng tam giác vào tủ cấy bật đèn tím để đảm bảo vô trùng, dao cấy cần khử trùng và hơ kỹ trên ngọn lửa đèn cồn. Dùng dao cấy cắt nhỏ các miếng thạch giống kích thƣớc khoảng 4cm2 cho vào mỗi bình tiến hành lắc 150 vòng/phút, nhiệt độ
phòng 28oC. Sau 20 ngày nấm phát triển tốt và đặc bình. Để có đƣợc nguồn giống nhiều hơn cung cấp cho các lần thí nghiệm tiếp theo có thể sử dụng nấm trong môi trƣờng lỏng cấy sang các bình môi trƣờng mớị Lúc này đã hoạt hóa thành công nấm giống từ môi trƣờng thạch sang môi trƣờng lỏng.
Để có thể lên men thu sinh khối trong nồi lên men công nghiệp 100L