5. Những đóng góp của luận văn:
2.2.1. Phƣơng pháp nhân giống nấm, cấy chuyển giống nấm và lên men
men
Chủng Phellinus linteus đƣợc làm thuần trên đĩa thạch. Nuôi cấy liên tục và duy trì trên môi trƣờng thạch khoai tây glucosẹ Nuôi cấy lỏng sợi nấm
đƣợc bắt đầu bằng cách chuyển sợi nấm từ nuôi cấy trên đĩa petri vào môi
trƣờng nuôi cấy tối ƣu lỏng. Tiến hành nhân giống các cấp trên môi trƣờng tối
ƣụ Sau đó thực hiện lên men từ bình tam giác đến bình lên men 100 lít chứa
65 lít môi trƣờng. Điều kiện lên men đƣợc điều chỉnh ở nhiệt độ từ 27oC đến 28oC. Tốc độ xục khí là 1 lít khí/lít dung dịch/phút. Tốc độ khuấy từ 100 đến
200 vòng, tùy theo giai đoạn của sợi nấm phát triển và độ bền của máy, nhằm
đảm bảo sinh khối phát triển tốt, không vón cục và bảo toàn trục khuấy của máỵ
* Nhân giống nấm và cấy chuyển giống nấm
Để có thể nhân giống trên môi trƣờng thạch thì cần chuẩn bị môi trƣờng thạch khoai tây theo công thức phía trên (Khoai tây 200 g/L, Glucose 20 g/L, Agar 20 g/L, nƣớc 1000 ml). Tiến hành hấp khử trùng môi trƣờng ở nhiệt độ 121oC trong vòng 30 phút để môi trƣờng trở thành vô trùng. Cần chuẩn bị trƣớc các đĩa petri đã khử trùng, bật đèn tím trƣớc để diệt khuẩn tủ cấỵ Lấy môi trƣờng ra khỏi nồi hấp, cho vào tủ cấy và để nguộị Thao tác đổ đĩa thạch cần đều tay, mỗi đĩa petri có khoảng 20ml môi trƣờng thạch, chờ đĩa thạch đông nguội thì úp ngƣợc đĩạ Khi đã có các đĩa môi trƣờng thạch, chủng nấm PL đƣợc cắt miếng kích thƣớc khoảng 1cm2từ đĩa thạch giống và cấy tại điểm chính giữa đĩa thạch, bọc kín và nuôi trong tủ ở điều kiện nhiệt độ 28oC. Khi đã có đƣợc các đĩa thạch chứa chủng nấm PL thì tiến hành chuẩn bị MTTƢ để tiến hành nhân giống trong môi trƣờng lỏng. MTTƢ đƣợc pha theo công thức đã đƣợc nêu, cho vào các bình tam giác 250ml mỗi bình chứa 100ml, tiến hành hấp khử trùng với điều kiện nhƣ đã làm với môi trƣờng thạch khoai tâỵ Trƣớc khi cấy thì cần cho giống và các bình môi trƣờng tam giác vào tủ cấy bật đèn tím để đảm bảo vô trùng, dao cấy cần khử trùng và hơ kỹ trên ngọn lửa đèn cồn. Dùng dao cấy cắt nhỏ các miếng thạch giống kích thƣớc khoảng 4cm2 cho vào mỗi bình tiến hành lắc 150 vòng/phút, nhiệt độ
phòng 28oC. Sau 20 ngày nấm phát triển tốt và đặc bình. Để có đƣợc nguồn giống nhiều hơn cung cấp cho các lần thí nghiệm tiếp theo có thể sử dụng nấm trong môi trƣờng lỏng cấy sang các bình môi trƣờng mớị Lúc này đã hoạt hóa thành công nấm giống từ môi trƣờng thạch sang môi trƣờng lỏng.
Để có thể lên men thu sinh khối trong nồi lên men công nghiệp 100L (thể tích môi trƣờng lên men là 65L) cần chuẩn bị lên men nhân giống trong bình 5L. Tiến hành pha 3,5L môi trƣờng trong bình 5L, hấp khử trùng và để nguộị Trƣớc khi cấy bật đèn tím để khử trùng. Hơ kỹ các miệng bình tam giác cũng nhƣ miệng bình sục 5L trên ngọn lửa đèn cồn, sử dụng pipet 5ml để hút mẫu từ bình tam giác cấy vào bình 5L với cấp giống là 10%. Tiến hành sục khí và sau 7 ngày đã có thể sử dụng để tiến hành lên men trong nồi 100L.
Hệ thống bình lên men 5L bao gồm bình và 3 ống dây (Hình 2.1). Một ống dây đƣợc nối với màng lọc khí, không khí đi qua màng lọc vào bình là không khí sạch không còn các tác nhân gây nhiễm. Một ống dây thoát khí ra ngoài cân bằng áp suất trong bình, đƣợc cho vào nƣớc javel vô trùng nhằm hạn chế hiện tƣợng nhiễm trùng ngƣợc vào bình khi bị mất điện không có không khí đi vàọ Ống dẫn còn lại bơm mẫu vào nồi lên men 65L.
Hình 2. 1. Bình sục 5L
*Lên men thu sinh khối
Kết quả từ nhiều thí nghiệm cho thấy các điều kiện tối ƣu cho sự tăng trƣởng sợi nấm của PL đƣợc sàng lọc ở nhiệt độ 27°C, pH 6.0. Để lên men thì trƣớc tiên cần khử trùng nồi lên men, các van khí, ống dẫn ở nhiệt độ121oC.
121oC. Sau khi đã có môi trƣờng vô trùng và mẫu nấm PL, tiến hành bơm mẫu vào nồi và cài đặt các thông số để lên men.