5. Những đóng góp của luận văn:
2.2.5. Phƣơng pháp xác định độc tính bán trƣờng diễn
Phƣơng pháp thử nghiệm và đánh giá dựa trên tham khảo tài liệu về phƣơng pháp xác định độc tính của thuốc [35] và hƣớng dẫn của Tổ chức hợp tác và phát triển kinh tế cho các thử nghiệm về hóa học (OECD guidelines for testing of chemicals [36]) nhƣ sau:
Sinh khối nấm Thƣợng hoàng đã đƣợc sấy với phƣơng pháp sấy thăng
hoạ Sau khi sấy, sinh khối khô đƣợc nghiền thành bột mịn và sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theọ Việc xác định độc tính bán trƣờng diễn của bột sinh khối nấm Thƣợng hoàng đƣợc tiến hành với các thí nghiệm trên động vật thí nghiệm là thỏ. Bố trí thí nghiệm và thử với các mức liều khác nhaụ Theo dõi và đánh giá, số liệu thực nghiệm đƣợc trình bày dƣới dạng giá trị trung bình cộng trừ độ lệch chuẩn (mean ± SD) và đƣợc xử lý thống kê bằng trắc nghiệm Student để so sánh sự khác nhau của cùng một chỉ số giữa nhóm đối chứng và nhóm thử nghiệm. Thí nghiệm đƣợc thực hiện tại Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung Ƣơng. Cụ thể nhƣ sau:
* Chuẩn bị mẫu thử
- Lựa chọn mức liều thử nghiệm: Chúng tôi dựa trên liều tối đa dự kiến dùng trên ngƣời là 9 g trà túi lọc/ngƣời/ngày và sử dụng hệ số chuyển đổi liều giữa thỏ và ngƣời là 3,1 để lựa chọn 2 mức liều thử nghiệm là:
0 0,17 0,28 0,4 0,58 y = 0,139x + 0,008 R² = 0,9922 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0 1 2 3 4 5 G ía tr ị O D 540nm Nồng độ Glucose (mg/ml) Đƣờng chuẩn glucose
+ Liều tƣơng ứng với mức liều dự kiến cho ngƣời: 0,558 g/kg thỏ/ngàỵ
+ Liều cao gấp 5 lần liều dự kiến cho ngƣời: 2,792 g/kg thỏ/ngàỵ
- Cách xử lý và chuẩn bị mẫu thử:
+ Mẫu đối chứng: Nƣớc
+ Hỗn dịch A (liều cao gấp 5 liều dự kiến cho người): Cân 67 g
mẫu thử ngâm trong 240 ml nƣớc sôi trong khoảng 15 phút, loại bỏ bã thu
lấy phần hỗn dịch.
+ Hỗn dịch B (liều tương ứng với liều dự kiến cho ngườ)i: Pha
loãng 40 ml hỗn dịch A với nƣớc vừa đủ 160 ml (hỗn dịch B).
* Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm đƣợc tiến hành trên 21 thỏ, chia thành 3 nhóm: mỗi nhóm 07 con. Bố trí thí nghiệm và thử với các mức liều theo Bảng 1.
Bảng 2. 5: Các mức liều thử nghiệm bán trƣờng diễn trên thỏ. Nhóm Số thỏ thí nghiệm Thể tích cho uống (ml/kg thỏ) Liều dùng (g mẫu thử/kg thỏ/ngày) Chứng 07 10,0 ml nƣớc/kg thỏ --- Thử 1 07 10,0 ml hỗn dịch B/kg thỏ 0,558 g Thử 2 07 10,0 ml hỗn dịch A/kg thỏ 2,792 g
* Theo dõi và đánh giá
- Theo dõi thỏ hàng ngày về mức độ tiêu thụ thức ăn, nƣớc uống, thể trạng và vận động, tình trạng phân, nƣớc tiểu, các biểu hiện bất thƣờng (nếu có) của thỏ.
- Xác định cân nặng của thỏ tại các thời điểm 0, 7, 14, 21, 28 ngày uống mẫu thử và 14 ngày sau khi dừng uống mẫu thử.
- Xét nghiệm các chỉ số huyết học liên quan tới chức năng tạo máu (số lƣợng hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, hemoglobin, hematocrit), các chỉ số liên quan tới chức năng gan (AST, ALT, protein toàn phần, bilirubin toàn phần, cholesterol), các chỉ số liên quan tới chức năng thận (creatinin, urea), chỉ số glucose tại các thời điểm 0, 14, 28 ngày uống mẫu thử và 14 ngày
sau khi dừng uống mẫu thử. So sánh kết quả của nhóm thử và nhóm chứng theo phƣơng pháp thống kê.
- Sau thử nghiệm động vật đƣợc mổ để quan sát đại thể các tổ chức tim, gan, thận, phổi, dạ dày, ruột của tất cả các thỏ.
- Lấy ngẫu nhiên 03 thỏ/nhóm, tiến hành làm tiêu bản giải phẫu mô
bệnh học gan, thận để đánh giá vi thể các tổ chức trên ngay sau khi dừng uống mẫu thử.
Bƣớc 4. Trình bày và xử lý số liệu
Số liệu thực nghiệm đƣợc trình bày dƣới dạng giá trị trung bình cộng trừ độ lệch chuẩn (mean ± SD) và đƣợc xử lý thống kê bằng trắc nghiệm
Student để so sánh sự khác nhau của cùng một chỉ số giữa nhóm chứng và nhóm thử.
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN