5. Những đóng góp của luận văn:
3.2.1. Các bƣớc trong quy trình
Bƣớc 1. Giống gốc
Giống gốc là giống nấm dạng sợi, đƣợc nhân trên môi trƣờng thạch PGA bằng cách cắt một miếng thạch kích thƣớc khoảng 0,7-1 cm2 đặt lên giữa đĩa thạch mới và ủtrong điều kiện 7-10 ngày ở tủấm, nhiệt độ 25-270C, bọc kín. Khi sợi nấm lan gần hết bề mặt đĩa thạch thì giống đƣợc bọc kín và
lƣu trữ theo các cách lƣu trữ giống hoặc đƣợc cấy chuyển sang môi trƣờng lỏng để nhân giống cấp Ị Giống đƣợc kiểm tra độ tạp nhiễm bằng cách quan
sát bề mặt sợi nấm trên đĩa thạch và dùng móc cấy lấy 1 chút sợi nấm đƣa lên
tiêu bản soi dƣới kính hiển vi quang học. Giống không tạp nhiễm, phát triển tốt đƣợc sử dụng để nhân giống cấp Ị
Bƣớc 2. Giống cấp I
Giống cấp I là giống gốc đƣợc nhân trong môi trƣờng lỏng MTTƢ.
Giống gốc đƣợc cắt nhỏ thành những mảnh nhỏ sử dụng dao mổđã khử trùng.
Sau đó giống gốc đƣợc cấy chuyển vào 50 ml môi trƣờng lỏng MTTƢ trong bình 250 ml. Bình đƣợc lắc ở tốc độ 150 vòng/phút, nhiệt độ 270- 280C trong vòng 7-10 ngàỵ Nhiệt độ có thể thay đổi trong tùy thuộc vào mùa trong năm.
Mùa hè thƣờng nhiệt độđƣợc đặt là 280C và các mùa khác điều chỉnh là 270C.
Điều này giúp giảm áp lực cho máy lắc bởi sự chênh lệch nhiệt độ với môi
trƣờng bên ngoàị Đây là bƣớc khởi đầu và chuyển trạng thái của sợi nấm mọc từ môi trƣờng bán rắn (thạch) sang môi trƣờng lỏng. Giống cấp I đƣợc kiểm tra khả năng sinh trƣởng và độ tạp nhiễm theo cách tƣơng tự nhƣ với giống gốc là quan sát bằng mắt thƣờng và dƣới kính hiển vi quang học. Khi quan sát bằng mắt thƣờng, ở môi trƣờng lỏng, giống không tạp nhiễm có dung dịch môi trƣờng trong suốt và màu nâu đậm. Giống cấp I không tạp nhiễm,
sinh trƣởng tốt đƣợc cấy chuyển để nhân giống cấp IỊ
Bƣớc 3. Giống cấp II
Giống cấp I tiếp tục đƣợc cấy chuyển ở tỉ lệ khoảng 10% vào bình tam
giác 1 lít trong môi trƣờng MTTƢ, thể tích môi trƣờng cuối cùng có trong bình là 500 ml. Bình tam giác 1 lít này tiếp tục đƣợc lắc ở tốc độ 150 vòng/phút, nhiệt độ 27oC đến 28oC trong vòng 5-7 ngàỵ Giống cấp II đƣợc kiểm tra khả năng sinh trƣởng và độ tạp nhiễm. Mẫu giống đảm bảo tiêu chuẩn không tạp nhiễm đƣợc tiến hành tiếp giống sang bình lên men 5 lít.
Bƣớc 4. Giống cấp III
Giống cấp II tiếp tục đƣợc cấy chuyển ở tỉ lệ khoảng 14% vào bình lên
men 5 lít trong môi trƣờng MTTƢ, thể tích môi trƣờng cuối cùng có trong bình là 3500 ml hay 3,5 lít. Hệ thống bình lên men 5 lít đƣợc đặt trong phòng
điều hòa ở nhiệt độ 27oC đến 28oC. Tốc độ xục khí là 1 lít khí/lít dung dịch/phút. Thời gian lên men tại bình lên men 5 lít này là 5-7 ngày tùy thuộc
tra khả năng sinh trƣởng và độ tạp nhiễm. Mẫu giống đảm bảo tiêu chuẩn không tạp nhiễm đƣợc tiến hành tiếp giống sang bình lên men 100 lít.
Bƣớc 5. Lên men
Toàn bộ 3,5 lít dịch nhân giống cấp III ở bƣớc 4 phía trên đƣợc tiếp sang bình lên men 100 lít chứa 65 lít môi trƣờng MTTƢ có bổ sung Penicillin/Streptomycin ở nồng độ 1 (IU/ml) /2 (µg/ml) và chất phá bọt (50
ppm) đƣợc cấp khi quan sát thấy bọt xuất hiện. Điều kiện lên men đƣợc điều chỉnh ở nhiệt độ từ 27oC đến 28oC. Tốc độ xục khí là 1 lít khí/lít dung dịch/phút. Tốc độ khuấy từ 100 đến 150 vòng, tùy theo giai đoạn của sợi nấm phát triển và độ bền của máỵ Thông thƣờng, trong vòng 2 ngày đầu, tốc độ
khuấy có thể để ở 100 vòng/phút. Từ ngày thứ 3 trở lên, tốc độ khuấy điều chỉnh lên xuống liên tục từ 100 vòng/phút đến 150 vòng/phút nhằm đảm bảo sinh khối phát triển tốt, không vón cục và bảo toàn trục khuấy của máỵ Quá trình lên men tại thiết bị này đƣợc duy trì trong vòng 12-15 ngày nhằm mục
đích giúp sợi nấm có thể tích lũy các hoạt chất sinh học quý của chúng.
Bƣớc 6. Thu sinh khối
Sử dụng máy vắt ly tâm để thu sinh khốị Một ống dây đƣờng kính khoảng 2cm đƣợc nối với đầu ra của bình lên men. Khi mở đầu này thì sinh khối từ bình lên men trực tiếp chảy vào trong máy vắt ly tâm. Cho máy chạy ở
tốc độ 3000 vòng/phút trong 20 phút để thu sinh khốị Mỗi mẻ có thể tích 10
lít môi trƣờng. Dịch lên men chảy ra ngoài trong khi sinh khối đƣợc giữ lại trong máy vắt ly tâm. Kết thúc mỗi mẻ, sinh khối đƣợc lấy ra và cất vào tủ
lạnh để chờ các bƣớc tiếp theọ
Các thông số sau khi hiệu chỉnh các bƣớc của quy trình trên đƣợc tóm tắt trong bảng sau:
Bảng 3. 1: Thông số kỹ thuật trong quá trình lên men quy mô 100 lít/mẻ
TT Các bƣớc trong quy trình
Thông số
1 Bƣớc 1: Giống gốc - Môi trƣờng thạch PGẠ
- Kích thƣớc khoảng 0,7- 1 cm2. - Ủ trong điều kiện 7-10 ngày ở tủ ấm.
- Nhiệt độ 25-27oC, bọc kín.
- Giống không tạp nhiễm, phát triển tốt đƣợc sử dụng để nhân giống cấp Ị 2 Bƣớc 2: Giống cấp I - Môi trƣờng lỏng MTTƢ. - Thể tích 50 ml môi trƣờng lỏng MTTƢ trong bình 250 ml. - Tốc độ lắc 150 vòng/phút. - Nhiệt độ 27oC. - Thời gian 7 - 10 ngàỵ
- Giống cấp I không tạp nhiễm, sinh trƣởng tốt đƣợc cấy chuyển để nhân giống cấp IỊ
3 Bƣớc 3: Giống cấp II - Môi trƣờng MTTƢ.
- Tỉ lệ cấy chuyển khoảng 10%.
- Thể tích môi trƣờng là 500 ml vào bình tam
giác 1 lít.
- Tốc độ lắc 150 vòng/phút.
- Nhiệt độ 27oC đến 28oC. - Thời gian 5 - 7 ngàỵ
- Mẫu giống đảm bảo tiêu chuẩn không tạp nhiễm đƣợc tiến hành tiếp giống sang bình lên
men 5 lít.
4 Bƣớc 4: Giống cấp III - Môi trƣờng MTTƢ.
- Tỉ lệ cấy chuyển khoảng 14%.
- Thể tích môi trƣờng 3,5 lít trong bình lên
men 5 lít.
- Nhiệt độ 27oC đến 28oC.
- Tốc độ xục khí là 1 lít khí/lít dung dịch/phút.
- Thời gian 5-7 ngàỵ
- Mẫu giống đảm bảo tiêu chuẩn không tạp nhiễm đƣợc tiến hành tiếp giống sang bình lên
men 100 lít.
5 Bƣớc 5: Lên men - Môi trƣờng MTTƢ.
- Thể tích môi trƣờng 65 lít trong bình lên men 100 lít - Penicillin/Streptomycin nồng độ 1 (IU/ml) /2 (µg/ml) - Chất phá bọt (50 ppm). - Nhiệt độ từ 27oC đến 28oC. - Tốc độ xục khí là 1 lít khí/lít dung dịch/phút. - Tốc độ khuấy từ 100 đến 200 vòng, tùy theo
giai đoạn của sợi nấm phát triển .
- Thời gian trong vòng 5-7 ngàỵ
- Mẫu giống đảm bảo tiêu chuẩn không tạp nhiễm đƣợc tiến hành tiếp giống sang bình lên
men 500 lít.
- Hoặc thu sinh khối để dùng cho các mục đích khác trong khoảng 12 – 15 ngàỵ
6 Bƣớc 6. Sinh khối - Máy vắt ly tâm để thu sinh khốị
- Tốc độ 3000 vòng/phút trong 20 phút.
- Thể tích 10 lít môi trƣờng/mẻ.
Quy trình nhân giống và lên men đƣợc tóm tắt theo sơ đồ sau:
Hình 3. 6: Sơ đồ quy trình công nghệ lên men sản xuất sinh khối nấm Thƣợng hoàng trên quy mô bình lên men 100 lít/mẻ
Sinh khối Giống cấp I
(Bình 250ml, 50ml MTTƢ 150 vòng/phút, 7-10 ngày, 27o-28oC)
Giống gốc
(Nấm dạng sợi, trên thạch PGA)
Cấy chuyển, rắn –lỏng Giống cấp II (Bình 1 lít, 500ml MTTƢ,150 vòng/phút, 5-7 ngày, 27o-28oC) Cấy chuyển, lỏng - lỏng Giống cấp III (Bình 5 lít, 3,5 lít MMTƢ, sục khí 1lít/lít/phút, 5-7 ngày, 27o-28oC) Cấy chuyển, lỏng – lỏng Lên men
(Thiết bị lên men 100 lít, 65 lít MTTƢ, sục khí 1lít/lít/phút, Khuấy 100-150 vòng, 12-15 ngày, 27o-28oC) Vắt li tâm ( 3000 vòng/phút, 20 phút/mẻ ( Dịch nuôi Cấy chuyển, lỏng – lỏng