2.2.5.1. Phương pháp tạo liposome
Hình 2.3. Quy trình tạo màng bao hoạt chất dạng liposome. ▪ Quy trình tổng hợp:
- Cân và hòa tan lecithin, vitamin E vào dung môi hữu cơ thích hợp. - Tiến hành cô quay áp suất giảm ở 45oC trong 4 giờ để loại dung môi hữu cơ. Áp suất chân không được điều chỉnh để loại dung môi bằng cách cho bay hơi từ từ, không quá nhanh tạo màng lipid mỏng và trong suốt bám quanh thành bình.
- Khi đã tạo được màng lipid khô hoàn toàn, hỗn hợp được hydrate hóa với pha nước chứa Tween 80 khuấy 400 vòng/phút ở 60 oC trong 2 giờ đến khi lớp màng lipid mỏng bong ra hết khỏi thành bình và làm lạnh nhanh hệ tiểu phân nano thu được.
2.2.5.2. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng quá trình tạo hệ nano liposome
2.2.5.2.1. Dung môi hòa tan lipid
Tổng hợp liposome bằng phương pháp hydrate hóa màng mỏng lipid thường sử dụng dung môi hữu cơ hòa tan lipid là methanol, chloroform hoặc hỗn hợp chloroform:methanol với tỷ lệ nhất định vì các dung môi này dễ bay hơi nên thường
Cô quay loại dung môi hữu cơ 45oC trong 4 giờ
Hòa tan trong dung môi hữu
cơ Lecithin:vitamin E
Cô quay tạo màng lipid Hydrat hóa tạo
liposome Nước cất chứa
Tween 80 Khuấy 400 rpm ở 60oC trong 2 ờ
43 không để lại dung môi tồn dư trong sản phẩm (ts chloroform = 61,62 oC, ts methanol = 64,7 oC). Do đó nghiên cứu tiến hành khảo sát ba dung môi hòa tan lipid là: cloroform, methanol và hỗn hợp dung môi chloroform:methanol (2:1).
2.2.5.2.2. Môi trường hydrate hóa
Khảo sát ba môi trường hydrate hóa tạo liposome là: nước cất, đệm pH 5,0 và đệm pH 7,4. Sử dụng lần lượt ba môi trường hydrate hóa chứa Tween 80 ở nhiệt độ 60oC trong 2 giờ đến khi lớp màng lipid bong hết khỏi thành bình. Kết quả khảo sát được đánh giá dựa vào tính chất hệ phân tán và độ ổn định để lựa chọn môi trường hydrate thích hợp.
2.2.5.2.3. Nhiệt độ hydrate hóa
Khảo sát 5 nhiệt độ hydrate hóa là: nhiệt độ phòng, 50oC, 60oC, 70oC và 80oC. Sử dụng môi trường hydrate hóa chứa Tween 80 đã được chọn, tiến hành hydrate hóa lần lượt ở 5 nhiệt độ khảo sát trong 2 giờđến khi lớp màng lipid bong ra hết khỏi thành bình. Kết quả khảo sát được đánh giá dựa vào tính chất hệphân tán và độổn định để lựa chọn nhiệt độ hydrate thích hợp.
2.2.5.2.4. Tỷ lệ lecithin:vitamin E
Bào chế liposome theo phương pháp hydrate hóa màng mỏng với tỷ lệ lecithin:vitamin E (w/w) lần lượt là 9:1, 8:2, 7:3, 6:4 và 5:5. Kết quả khảo sát tỷ lệ lecithin:vitamin E được đánh giá dựa trên cảm quan và độổn định ởđiều kiện 2 – 8oC sau một tuần bảo quản.
2.2.5.2.5. Khảo sát chất hoạt động bề mặt trong pha nước
Bào chế liposome theo phương pháp hydrate hóa màng mỏng lipid với tỷ lệ lecithin:vitamin E được lựa chọn. Tỷ lệ Tween 80 trong pha nước được khảo sát ở các nồng độ lần lượt là 0,1%, 0,5%, 1,5% và 2,0% (w/v). Kết quả khảo sát dựa trên đánh giá cảm quan và độổn định ở điều kiện 2-8oC sau một tuần bảo quản.
2.2.6. Nghiên cứu giảm kích thước tiểu phân
Phương pháp hydrate hóa màng lipid thường tạo ra hạt liposome đa lớp và có kích thước lớn, do đó liposome sau bào chế cần được giảm kích thước hạt bằng
thiết bị đồng nhất mẫu. Nghiên cứu sử dụng phương pháp siêu âm kết hợp phương pháp đồng hóa:
- Siêu âm (thiết bị siêu âm Elma S 80 H): 40 phút.
- Đồng hóa (máy đồng hóa áp suất cao Emulsiglex C5): 800 bar, 10 chu kỳ. 2.2.7. Nang hóa hoạt chấtvào hệ liposome
2.2.7.1. Khảo sát lượng tá dược tạo khung
Hệ phân tán liposome sau khi giảm kích thước được đông khô với maltodextrin. Khảo sát hàm lượng sử dụng với các tỷ lệ maltodextrin:lipid lần lượt là 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4 và 1:5. Lượng tá dược maltodextrin sử dụng được đánh giá dựa trên cảm quan, kích thước trung bình của tiểu phân, chỉ sốđa phân tán và thế zeta.
44
2.2.7.2. Khảo sát tỷ lệ lượng cao chứa dược chất nang hóa vào hệ liposome
Khảo sát tỷ lệlipid:cao dược chất lần lượt là 1:1, 2:1, 3:1, 4:1. Vì shogaol (cao gừng), apigenin (cao cần tây) và kém tan trong nước nên được phân tán vào pha lipid trong quá trình bào chế. Trong khi đó fucoidan (cao rong nâu) tan tốt trong nước nên được phân tán vào pha nước chứa Tween 80. Kết quả khảo sát lượng cao chứa dược chất được nang hóa vào liposome được đánh giá dựa trên cảm quan và độổn định ở điều kiện 2-8oC sau một tuần bảo quản.
2.2.7.3. Khảo sát lượng tác nhân hướng đích Tween 80-EDA-FA
Khảo sát tỷ lệ Tween 80-EDA-FA lần lượt là 10%, 15%, 20% tổng khối lượng liposome. Kết quả khảo sát lượng tác nhân hướng đích Tween 80-EDA-FA được đánh giá dựa trên cảm quan và độổn định ởđiều kiện 2-8oC sau một tuần bảo quản.
2.2.7.4. Khả năng nang hóa hoạtchất
Hiệu suất nang hóa thuốc của liposome được xác định thông qua việc định lượng shogaol (cao gừng), fucoidan (cao rong nâu), apigenin (cao cần tây) được nang hóa vào liposome bằng HPLC. Lượng hoạt chất tự do trong hệ phân tán liposome bị loại đi khi lọc mẫu qua màng MWCO 3500 Dalton. Lượng hoạt chất được nang hóa vào liposome được tính toán bằng hiệu số giữa lượng hoạt chất toàn phần và lượng hoạt chất tự do theo công thức:
Hiệu suất nang hóa thuốc (%) = Khối lượng thuốc được nang hóa vào liposome 100 Khối lượng thuốc toàn phần
45
Chương III: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1. Tổng hợp EDA-FA ở quy mô phòng thí nhiệm
3.1.1. Xác định cấu trúc hóa học
Hình 3.1. Phổ FT-IR của FA, EDA, EDA-FA
Phân tích phổ hồng ngoại FT-IR của sản phẩm EDA-FA trong khoảng từ 4000- 400 cm-1, có tín hiệu tại 3415-3265 cm-1 của amine bậc 2 (-N-H-); 1645 cm-1 của C=O (liên kết amide) và 1556 cm-1là dao động uốn cong của liên kết N-H.
Hình 3.2. Phổ1H-NMR của Acid Folic -NH- C=O -N-H 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 EDA-FA FA cm-1 EDA
46
Hình 3.3. Phổ1H-NMR của EDA-FA
Kết quả phân tích phổ1H-NMR của sản phẩm EDA-FA cho thấy, trong cấu trúc EDA-FA có các proton có độ chuyển dịch hóa học điển hình: 1H-NMR(500 MHz, DMSO-d6) 1.90~2.25 (4H, C23, C24), 2.79 ( 2H, C32), 4.19 - 4.47 (7H, C12, N34, C22, C33), 6.63 - 6.65 ( 2H, C15, C19), 6.85 -6.88 (3H, N11, N13), 7.58 - 7.60 (2H, C16, C18), 7.78 (1H, N21), 8.62 (1H, C8). Độ chuyển dịch hóa học của mẫu EDA-FA tổng hợp phù hợp với độ dịch chuyển hóa học của Liu, Li et al. và Trindade, Frade et al [5].
47 Kết quả phân tích phổ13C-NMR của sản phẩm EDA-FA cho thấy, trong cấu trúc EDA-FA có các carbon có độ chuyển dịch hóa học điển hình: 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) 27.99~31.77 (C23, C24), 39.00-41 (C32, C32), 46.1 (C12), 53.87 (C22), 11.24 (C15, C19),122.26 (C17), 128.11 (C16, C18), 147.79 (C8, C9), 150.33 (C14), 154~155 (C4, C2), 164.49 (C20), 175.66 (C25, C28,C6). Độ chuyển dịch hóa học của mẫu EDA-FA tổng hợp phù hợp với độ dịch chuyển hóa học của Trindade, Frade et al. [5].
Kết quả phân tích hồng ngoại FT-IR và phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR và 13C-NMR chứng minh sản phẩm EDA-FA có cấu trúc đúng với cấu trúc EDA-FA theo lý thuyết.
3.1.2. Khảo sát và xây dựng quy trình tổng hợp EDA-FA
a) Hiệu suất tổng hợp EDA-FA theo nhiệt độ
Kết quả thực hiện phản ứng tổng hợp EDA-FA với tỉ lệ mol EDA/FA (1 : 1), thời gian phản ứng 12 giờ và nhiệt độ phản ứng thay đổi từ nhiệt độphòng đến 80 ℃được thể hiện ở Bảng 3.1 và Hình 3.5.
Bảng 3.1. Hiệu suất tổng hợp EDA-FA theo nhiệt độ Nhiệt độ (℃) Phân tử lượng (g/mol) Số mol (mmol) Khối lượng lý thuyết (g) Khối lượng thực tế (g) Hiệu suất (%) RT 483,5 1 0,4835 0,3020 62,53 60 483,5 1 0,4835 0,3814 78,97 70 483,5 1 0,4835 0,3601 74,55 80 483,5 1 0,4835 0,3493 72,31
Hình 3.5. Hiệu suất tổng hợp EDA-FA theo nhiệt độ
Từ kết quả ở Bảng 3.1 và Hình 3.5 cho thấy phản ứng tổng hợp EDA-FA đạt hiệu suất cao nhất ở 60 ℃ (78,97%) nên sử dụng 60 ℃để khảo sát thời gian phản ứng và tỉ lệ mol EDA/FA.
48 Kết quả thực hiện phản ứng tổng hợp EDA-FA tỉ lệ mol EDA/FA (1:1), nhiệt độ 60 ℃ và thời gian phản ứng từ 8 giờ đến 16 giờ được thể hiện ở Bảng 3.2 và Hình 3.6.
Bảng 3.2. Hiệu suất tổng hợp EDA-FA theo thời gian Thời gian (giờ) Phân tửlượng (g/mol) Số mol (mmol) Khối lượng lý thuyết (g) Khối lượng thực tế (g) Hiệu suất (%) 8 483,5 1 0,4835 0,3038 62,90 10 483,5 1 0,4835 0,3415 70,70 12 483,5 1 0,4835 0,3814 78,97 16 483,5 1 0,4835 0,3895 80,64
Hình 3.6. Kết quả hiệu suất tổng hợp EDA-FA theo thời gian phản ứng Kết quảở Bảng 3.2 và Hình 3.6 cho thấy phản ứng tổng hợp EDA-FA đạt hiệu suất cao nhất ở 16 giờ (80,64%). Tuy nhiên, khi phản ứng thay đổi từ 12 giờ đến 16 giờ, hiệu suất của phản ứng thay đổi không đáng kể. Vì vậy, sử dụng thời gian 12 giờ để khảo sát tỉ lệ mol EDA/FA.
c) Hiệu suất tổng hợp EDA-FA theo tỉ lệ mol
Kết quả thực hiện phản ứng tổng hợp EDA-FA với nhiệt độ 60 ℃, thời gian phản ứng 12 giờ và tỉ lệmol EDA/FA thay đổi từ(1:1) đến (2:1) được thể hiện ở Bảng 3.3
và Hình 3.7.
Bảng 3.3. Hiệu suất tổng hợp EDA-FA theo tỉ lệ mol Tỉ lệ mol Phân tửlượng
(g/mol) Số mmol (mmol) Khối lượng lý thuyết (g) Khối lượng thực tế (g) Hiệu suất (%) 1:1 483,5 1 0,4835 0,2935 60,77 1,2:1 483,5 1 0,4835 0,3265 67,60 1,5:1 483,5 1 0,4835 0,3814 78,96 2:1 483,5 1 0,4835 0,3841 79,52
49
Hình 3.7. Hiệu suất tổng hợp EDA-FA theo tỉ lệ mol
Từ kết quả ở Bảng 3.3 và Hình 3.7 cho thấy phản ứng tổng hợp EDA-FA đạt hiệu suất cao nhất ở tỉ lệmol (2:1) (79,52%). Tuy nhiên, khi thay đổi tỉ lệ mol EDA/FA từ(1,5:1) đến (2:1), hiệu suất của phản ứng thay đổi không đáng kể. Vì vậy sử dụng tỉ lệmol EDA/FA (1,5:1) để thực hiện phản ứng tổng hợp EDA-FA.
Từ kết quả khảo sát về hiệu suất phản ứng tổng hợp EDA-FA thay đổi theo nhiệt độ, thời gian phản ứng và tỉ lệ mol EDA-FA, sử dụng nhiệt độ 60 ℃, thời gian phản ứng 12 giờ, tỉ lệmol EDA/FA (1,5:1) để thực hiện phản ứng tổng hợp EDA-FA quy mô 30 g/mẻ và sử dụng sản phẩm EDA-FA này làm tác chất cho các phản ứng sau.
50
3.1.3. Tổng hợp EDA-FA quy mô 30 g/mẻ
▪ Quy trình tổng hợp EDA-FA
Hình 3.8. Quy trình tổng hợp EDA-FA quy mô 30 g/mẻ
Cân đong nguyên liệu
Acid folic Natri hydroxit Hòa tan Máy khuấy từ (300 rpm, 10 phút) Khuấy đều Máy khuấy từ (300 rpm, 60 oC, 12 giờ) Ethylenediamine Acid hydrocloric Tủa Máy đo pH (pH = 6) Ly tâm Máy ly tâm (10.000 rpm, 5 phút) Rửa tủa Nước cất (3 lần) Sấy khô Tủ sấy (65 oC, 6 giờ) Sản phẩm EDA-FA
51
Cách tiến hành:
Bước 1: Hòa tan 44,14 g acid folic vào 1000 mL dung dịch NaOH 0,04 M. Bước 2: Cho từ từ 12,02 g ethylene diamine vào dung dịch trên. Sau đó khuấy liên tục trong 12 giờở 60 oC bằng máy khuấy từ. Cho từ từ dung dịch HCl 0,2 M cho đến khi pH=6.
Bước 3: Hỗn hợp sản phẩm được ly tâm ở 10.000 rpm/5phút. Sản phẩm kết tủa được rửa 3 bằng với H2O để loại bỏ EDA thừa. Sấy khô ở 65 oC trong 6 giờ.
▪ Kết quả tổng hợp EDA-FA quy mô 30 g/mẻ
Bảng 3.4. Kết quả tổng hợp EDA-FA quy mô 30 g/mẻ Lần Phân tửlượng (g/mol) Số mol (mmol) Khối lượng lý thuyết (g) Khối lượng thực tế (g) Hiệu suất (%) 1 483,5 100 48,35 35,16 72,72 2 483,5 100 48,35 34,34 71,02 3 483,5 100 48,35 34,89 72,16 Trung bình 34,80 71,99 %RSD 1,2
Kết quả từ Bảng 3.4 cho thấy quy trình tổng hợp EDA-FA có tính ổn định và lặp lại (%RSD = 1,2 ). Hiệu suất tổng hợp trung bình đạt 71,99 %.
3.2. Tổng hợp Tween 80-EDA-FA quy mô phòng thí nghiệm
3.2.1. Xác định cấu trúc hóa học1
Hình 3.8. Phổ UV-Vis của FA, EDA-FA, Tween 80-EDA-FA, Tween 80
200 300 400 500 600 700 800 FA FA-EDA FA-EDA-Tween TWEEN nm
52 Kết quả phân tích phổ UV-Vis cho thấy sản phẩm tổng hợp Tween 80-EDA-FA có khoảng hấp thu đặc trưng ởbước sóng 220-250 nm tương ứng với phổ hấp thu của Tween 80. Ngoài ra, sản phẩm Tween 80-EDA-FA còn có khoảng hấp thu đặc trưng ởbước sóng 280-300 nm tương ứng với phổ hấp thu của EDA-FA.
Hình 3.9. Phổ FT-IR của Tween 80-EDA-FA, Tween 80, EDA-FA
Kết quả phân tích phổ FT-IR của sản phẩm Tween 80-EDA-FA trong khoảng 4000 - 400 cm -1 cho thấy có tín hiệu ở 3298 cm-1 của nhóm amine bậc 2 (-NH-) của EDA-FA; 2927 cm-1 và 1608 cm-1 của nhóm CH3-CH2- và -CH=CH- của Tween 80.
Hình 3.10. Phổ1H-NMR của Tween 80-EDA-FA
Phổ1H-NMR của sản phẩm Tween 80-EDA-FA cho thấy, trong cấu trúc Tween 80-EDA-FA có các proton có độ chuyển dịch hóa học điển hình: 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) 0,83-0,86 (3H, C1’), 1,23 (14H, C2’), 1,51 (2H, C3’), 1,91-1,95 (10H, C4’, C23), 2,22-2,26 (10H, C4’, C24), 6,63-6,65 (6H, C15, C19), 7.59-7,61 (6H, C16, C18). 4000 3000 2000 1000 Tween-EDA-FA Tween cm-1 EDA-FA CH3-CH2- -CH=CH-
53 Độ chuyển dịch hóa học của mẫu Tween 80-EDA-FA tổng hợp phù hợp với độ dịch chuyển hóa học của Liu, Li et al. và Trindade, Frade et al [5].
Kết quả phân tích UV-Vis, hồng ngoại FT-IR và phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H- NMR chứng minh sản phẩm Tween 80-EDA-FA có cấu trúc đúng với cấu trúc Tween 80-EDA-FA theo lý thuyết.
3.2.2. Khảo sát và xây dựng quy trình tổng hợp Tween 80-EDA-FA
a) Hiệu suất tổng hợp Tween 80-EDA-FA theo tỉ lệ mol
Kết quả thực hiện phản ứng tổng hợp Tween 80-EDA-FA ở nhiệt độ độ phòng, thời gian phản ứng 12 giờ và tỉ lệ mol Tween 80/EDA-FA thay đổi từ1:1 đến 1:3 được thể hiện ở Bảng 3.5 và Hình 3.11.
Bảng 3.5. Hiệu suất tổng hợp Tween 80-EDA-FA theo tỉ lệ mol Tỉ lệ mol Phân tửlượng
(g/mol) Số mmol (mmol) Khối lượng lý thuyết (g) Khối lượng thực tế (g) Hiệu suất (%) 1:1 2803,5 1 2,8035 1,1366 40,54 1:1,5 2803,5 1 2,8035 1,3274 47,35 1:2 2803,5 1 2,8035 1,5204 54,23 1:3 2803,5 1 2,8035 1,8012 64,24
Hình 3.11. Hiệu suất tổng hợp Tween 80-EDA-FA theo tỉ lệ mol
Kết quảthu được từ Bảng 3.53 và Hình 3.44 cho thấy hiệu suất phản ứng tăng khi tỉ lệ mol Tween 80/EDA-FA tăng từ 1:1 (40,54%) đến 1:3 (64,24%). Vì vậy sử dụng tỉ lệ mol Tween 80/EDA-FA (1 : 3) để khảo sát nhiệt độ và thời gian phản ứng tổng hợp Tween 80-EDA-FA.
b) Hiệu suất tổng hợp Tween 80-EDA-FA theo nhiệt độ
Kết quả thực hiện phản ứng tổng hợp Tween 80-EDA-FA với tỉ lệ mol Tween 80/EDA-FA (1:3), thời gian phản ứng 12 giờ và nhiệt độ phản ứng thay đổi từ nhiệt độphòng đến 80 ℃được thể hiện ở Bảng 3.54 và Hình 3.45.
54
Bảng 3.6. Hiệu suất tổng hợp Tween 80-EDA-FA theo nhiệt độ Nhiệt độ (℃) Phân tửlượng (g/mol) Số mmol (mmol) Khối lượng lý thuyết (g) Khối lượng thực tế (g) Hiệu suất (%) RT 2803,5 1 2,8035 1,7966 64,08 60 2803,5 1 2,8035 1,8013 64,25 70 2803,5 1 2,8035 1,8089 64,52 80 2803,5 1 2,8035 1,8152 64,75
Hình 3.12. Hiệu suất tổng hợp Tween 80-EDA-FA theo nhiệt độ
Kết quảở Bảng 3.6 và Hình 3.12 cho thấy hiệu suất của phản ứng tăng khi nhiệt độtăng. Hiệu suất của phản ứng tăng từ 64,08% (nhiệt độphòng) đến 64,75% (80℃). Do hiệu suất của phản ứng tăng không đáng kể nên chúng tôi chọn nhiêt độphòng để khảo sát thời gian phản ứng tổng hợp Tween 80-EDA-FA.
c) Hiệu suất tổng hợp Tween 80-EDA-FA theo thời gian phản ứng
Kết quả thực hiện phản ứng tổng hợp Tween 80-EDA-FA với tỉ lệ mol Tween 80/ EDA-FA (1:3), ở nhiệt độ phòng và thời gian phản ứng thay đổi từ 8 giờ đến 16 giờđược thể hiện ở Bảng 3.7 và Hình 3.13.