- Chuẩn bị mẫu hạt bụng để phõn tớch HPLC: Hạt bụng của cỏc giống nghiờn cứu được tỏch loại vỏ, phần nhõn được nghiền thành bột đồng nhất bằng
Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phõn lập gossypol từ hạt bụng
3.3. Tỷ lệ (-)-gossyopol/(+)-gossypol trong một số giống bụng ở Việt Nam
Cỏc nghiờn cứu trước đõy đó chỉ ra rằng, điều kiện mụi trường cú thể ảnh hưởng đến khối lượng hạt và hàm lượng gossypol tổng số nhưng khụng làm ảnh hưởng đến tỷ lệ giữa (-)-gossypol và (+)-gossypol. (-)-Gossypol đó được chứng minh là cú cỏc hoạt tớnh sinh học như chống ung thư, hoạt tớnh trỏnh thai nam mạnh hơn và ớt tỏc dụng phụ hơn (+)-gossypol. Tỷ lệ giữa đồng phõn (-)-gossypol và (+)-gossypol rất đa dạng trong cỏc giống và cỏc loài bụng khỏc nhau. Nhưng cho đến nay chưa cú cụng trỡnh nào được cụng bố về tỷ lệ cỏc đồng phõn (-)-gossypol và (+)-gossypol trong cỏc loài và giống bụng của Việt Nam. Do đú, từ cỏc sản phẩm (-)-gossypol và (+)-gossypol đó phõn lập được, chỳng tụi sử dụng nú với vai trũ làm chất đối chiếu để sơ bộ xỏc định tỷ lệ (-)- gossypol/(+)-gossypol trong hạt của một số giống bụng thuộc 2 loài bụng được trồng phổ biến hiện nay ở Việt Nam là G. barbadense và G. hirsutum bằng phương phỏp
HPLC. Phương phỏp này cũng đó được Stipanovic R. D. và cộng sự sử dụng để đỏnh giỏ tỷ lệ (-)-gossypol/(+)-gossypol trong hạt của cỏc loài bụng khỏc nhau [52].
Nguyờn tắc chung là tạo dẫn xuất của hỗn hợp (±)-gossypol trong hạt bụng với amine bất đối (R)-2-amino-1-propanol để tạo thành cỏc bazơ Schiff (-)- gossypol-(R)-2-amino-1-propanol và (+)-gossypol-(R)-2-amino-1-propanol. Sau đú, cỏc đồng phõn diastereomer này được phõn tớch trờn HPLC. Tuy nhiờn, trong hạt bụng cũn cú nhiều chất khỏc nữa, nờn ngoài 2 pic của 2 bazơ Schiff núi trờn cũn cú cỏc pic khỏc. Từ kết quả phõn tớch độ tinh khiết quang học của cỏc sản phẩm (-)-gossypol và (+)-gossypol, chỳng tụi đó xỏc định được thời gian lưu của (-)-gossypol-(R)-2-amino-1-propanol và của (+)-gossypol-L-2-amino-1-propanol tương ứng là 4,83 phỳt và 8,17 phỳt. Do đú, ở cựng điều kiện chạy HPLC, căn cứ theo thời gian lưu cựng với dữ liệu phổ tử ngoại cú thể xỏc định được vị trớ pic của hai chất này trong sắc ký đồ HPLC của hạt bụng.
Bờn cạnh đú, chỳng tụi chọn hỗn hợp (±)-gossypol của mẫu hạt bụng G. barbadense HD139 ([α]D ≈ 00) làm chất đối chiếu, cú tỷ lệ (-)-gossypol/(+)- gossypol ≈ 50/50 để kiểm tra tỷ lệ diện tớch pic tương ứng trờn HPLC. Thực hiện tạo dẫn xuất bazơ Schiff với amine bất đối (R)-2-amino-1-propanol rồi phõn tớch bằng HPLC chỳng tụi thu được 2 pớc chớnh tương ứng với cỏc dẫn xuất (+)- gossypol-(R)-2-amino-1-propanol và (-)-gossypol-(R)-2-amino-1-propanol cú thời gian lưu tương ứng là 4,82 phỳt và 8,13 phỳt và cú tỷ lệ diện tớch pic tương ứng lần lượt là 33,01% và 33,09% (Hỡnh 3.13, Phụ lục 17). Như vậy cú thể nhận thấy rằng tỷ lệ diện tớch pic trờn HPLC của cỏc bazơ Schiff (+)-gossypol-(R)-2- amino-1-propanol và (-)-gossypol-(R)-2-amino-1-propanol tương ứng với tỷ lệ cỏc đồng phõn (+)-gossypol và (-)-gossypol trong hỗn hợp của nú. Từ kết quả này, chỳng tụi cú thể đỏnh giỏ tỷ lệ cỏc đồng phõn quang học (+)-gossypol và (-)- gossypol trong hạt bụng thụng qua việc xỏc định tỷ lệ diện tớch pic của cỏc bazơ Schiff tương ứng bằng HPLC.
Hỡnh 3.13. Sắc ký đồ HPLC của bazơ Schiff (±)-gossypol-(R)-2-amino-1-propanol.
(+)-gossypol-(R)-2-amino-1-propanol cú t=4,82 phỳt, S=33,01%, (+)-gossypol-(R)-2- amino-1-propanol cú t=8,15 phỳt, S=33,09% (254 nm).
Bảng 3.3 là kết quả đỏnh giỏ tỷ lệ giữa hai đồng phõn quang học (-)- gossypol và (+)-gossypol trong hạt bụng của 4 giống bụng thuộc loài G. barbadense và 1 giống bụng thuộc loài G. hirsutum bằng phương phỏp HPLC.
Bảng 3.3. Tỷ lệ (-)-gossypol/(+)-gossypol trong một số giống bụng ở Việt Nam Loài Giống Tỷ lệ nhõn/hạt (%) (-)-Gossypol/(+)-Gossypol
G. barbadense HD129 63,1±1,2 51,4: 48.6 HD208 62,5 ±1,7 57,8: 42,2 HD138 58,3 ± 2,0 52,3: 47,7 HD139 62,6 ±1,5 50,3: 49,7 G. hirsutum VN01-2 60,2 ±1,2 39,7: 60,3
Ghi chỳ: Cỏc giỏ trị được biểu thị dưới dạng: giỏ trị trung bỡnh ± sai số
Bảng 3.3 cho thấy tỷ lệ (-)-gossypol/(+)-gossypol rất khỏc nhau trong cỏc loài và cỏc giống bụng của cựng một loài. Trong số cỏc giống bụng nghiờn cứu, mức độ dao động này trong khoảng từ (39,7: 60,3) đến (57,8: 42,2). Cỏc giống
với (+)-gossypol. Trỏi lại, (-)-gossypol cú hàm lượng thấp hơn nhiều so với (+)- gossypol (tỷ lệ 39,7 : 60,3) trong giống bụng VN01-2 thuộc loài Gossypium hirsutum (Hỡnh 3.14, Phụ lục 18, 19). Từ bảng kết quả cũng cho thấy tỷ lệ nhõn hạt bụng trờn tổng khối lượng hạt của cỏc giống trờn cả hai loài đều xấp xỉ 60%, khụng cú sự khỏc biệt lớn trong số cỏc giống nghiờn cứu thuộc 2 loài trờn.
Kết quả phõn tớch tỉ lệ (-)-gossypol/(+)-gossypol trong hạt của 2 loài G. barbadense và G. hirsutum ở Việt Nam phự hợp với những kết quả mà một số tỏc giả khỏc đó cụng bố trước đõy trờn 2 loài này. Rober D. Stipanovic xỏc định (-)-gossypol trong loài G. barnadense trong khoảng 44,7-58,4%, và trong G. hirsutim là 2,6-38% [52].
Hỡnh 3.14. Sắc ký đồ HPLC xỏc định tỷ lệ (-)-gossypol/(+)-gossypol trong hạt bụng HD208 và VN01-2. (+)-gossypol-(R)-2-amino-1-propanol cú t=4,8 phỳt, (+)-gossypol-
(R)-2-amino-1-propanol cú t=8,1 phỳt (254 nm).