- Chuẩn bị mẫu hạt bụng để phõn tớch HPLC: Hạt bụng của cỏc giống nghiờn cứu được tỏch loại vỏ, phần nhõn được nghiền thành bột đồng nhất bằng
Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phõn lập gossypol từ hạt bụng
3.1.2. Tinh chế gossypol bằng sắc ký cột silica gel
Từ kết quả định tớnh gossypol trong cao chiết DEE bằng sắc ký bản mỏng (mục 3.1.1) cho thấy gossypol cho một vết đậm ở Rf = 0,67 và cú sự phõn tỏch với vết lõn cận Rf = 0,72 do đú chỳng tụi nhận thấy cú thể tinh chế gossypol bằng sắc ký cột silica gel để bước đầu xỏc định cấu trỳc và dựng làm chất đối chiếu cho cỏc thử nghiệm về sau.
a b
Hỡnh 3.2. Sắc ký đồ cao DEE (a) và gossypol tinh sạch Rf = 0,67 (b) phõn lập từ hạt bụng G. barbadense L. HD139. Bản mỏng trỏng sẵn GF254 (Merck), hệ dung mụi : n- hexan/ethyl acetate/acetic acid = 9/1/0,4, hiện màu bằng thuốc thử H2SO4 20%.
Do gossypol cú cỏc nhúm –OH phenol cú khả năng tạo thành cỏc liờn kết hydro với cỏc nhúm –OH trờn chất hấp phụ silica gel gõy ra hiện tượng gossypol kộo dài trờn cột trong quỏ trỡnh rửa giải. Để trỏnh hiện tượng này, dung mụi rửa giải đó được thờm vào một lượng nhỏ acetic acid (1%), vừa cú tỏc dụng trỏnh sự kộo dài của gossypol trờn cột, vừa cú thể cú tỏc dụng làm bền gossypol.
Từ 2,07 g cao chiết DEE của hạt bụng HD139 khi tiến hành sắc ký qua cột sillica gel (60 g silica gel), hệ dung mụi rửa giải được sử dụng là n-hexan/ethyl acetate/acetic acid với độ phõn cực tăng dần: 100/0/1-80/20/1, cuối cựng chỳng
AA bằng cỏch hoà tan lại trong 5 ml DEE sau đú thờm 1,7 ml acetic acid băng. Sau 24 h, sản phẩm kết tinh được lọc bằng phễu lọc hỳt chõn khụng, rửa bằng 3 x 5 ml ete dầu, sấy khụ trong tủ sấy chõn khụng ở nhiệt độ 250C trong 24 h thu được 0,45 g chất rắn mầu vàng là G-AA. Cỏc số liệu về điểm chảy, phổ UV, IR và phổ cộng hưởng từ hạt nhõn của sản phẩm thu được trựng với cỏc dữ liệu đó cụng bố của G-AA [21].
Hỡnh 3.3. Phổ tử ngoại của G-AA từ hạt bụng G. barbadense L. G-AA cú 3 đỉnh hấp thụ cực đại ở 242, 288 và 364 nm (đo trong CHCl3) Điểm chảy: 178-180ºC
UV (λmax, CHCl3): 242, 288, 364 nm (Hỡnh 3.3) [α]D = + 140 (c = 0,25; CHCl3)
IR (KBr, cm-1): ν = 3514, 3436 (-OH), 2943, 2886 (-COOH), 1708 (C=O), 1615, 1579 (C=C), 1444, 1381, 1339, 1270 (CAr-O), 1171, 1061, 911, 948, 776. (Phụ lục 1)
1H NMR: δ = 15,21 (s, 2H, -OH); 11,15 (s, 2H, -CHO); 7,79 (s, 2H, -Ar-H); 6,45 (br s, 2H, -OH); 5,74 (s, 2H, -OH); 3,91 (s, 2H, -CH(CH3)2); 2,16 (s, 6H, -Ar-CH3); 2,09 (s, 3H, -CH3 acetic acid); 1,56 (d, J = 7Hz, 12H, -CH(CH3)2) ppm. (Phụ lục 2)
Hỡnh 3.4. Sắc ký đồ HPLC của G-AA tinh chế bằng sắc ký cột và kết tinh lại trong DEE/acetic acid băng. G-AA cho một pic cú thời gian lưu 7,94 phỳt, diện tớch pic
S>98% (254 nm).
Kết quả phõn tớch trờn HPLC (Hỡnh 3.4, Phụ lục 4) cho thấy sản phẩm G- AA đó phõn lập được bằng phương phỏp sắc ký cột chỉ cho duy nhất 1 pic cú thời gian lưu là 7,9 phỳt ở bước súng 254 nm. Cựng với cỏc số liệu về điểm chảy, phổ khối, phổ tử ngoại, NMR, kết quả này đó chứng tỏ sản phẩm G-AA mà chỳng tụi đó phõn lập được cú độ tinh khiết rất cao (theo diện tớch pic HPLC ở bước súng 254 nm). Do đú sản phẩm G-AA này được chỳng tụi sử dụng làm chất đối chiếu để định tớnh, định lượng cỏc sản phẩm gossypol hoặc G-AA sau này.
Sản phẩm thu được là hỗn hợp racemic vỡ cú [α]D = + 140 (c 0,25; CHCl3). Tuy nhiờn, trờn SKLM chỉ cú 1 vết duy nhất (Rf = 0,67) và trờn HPLC chỉ cú 1 pớc duy nhất tại t = 7,9 phỳt. Do đú cú thể kết luận rằng rất khú phõn tỏch cũng như định tớnh hay định lượng cỏc đồng phõn (-)-gossypol và (+)-gossypol trong hỗn hợp (±)-gossypol bằng cỏc phương phỏp SKLM và HPLC một cỏch trực tiếp.