- Chuẩn bị mẫu hạt bụng để phõn tớch HPLC: Hạt bụng của cỏc giống nghiờn cứu được tỏch loại vỏ, phần nhõn được nghiền thành bột đồng nhất bằng
Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phõn lập gossypol từ hạt bụng
3.2.3.2. Đỏnh giỏ độ tinh khiết quang học của (-)-gossypol và (+)-gossypol
Độ tinh khiết quang học của sản phẩm là một trong số cỏc chỉ tiờu quan trọng nhất để đỏnh giỏ hiệu quả của phương phỏp phõn tỏch đồng phõn quang học và cũng là để đỏnh giỏ chất lượng sản phẩm. Dựa vào giỏ trị độ quay cực cú thể đỏnh giỏ được phần nào độ tinh khiết quang học của sản phẩm. Sản phẩm (-)- gossypol chỳng tụi đó điều chế được cú [α]D = -3680 (c 0,311; CHCl3), được đỏnh giỏ là cú độ tinh khiết quang học rất cao dựa trờn tài liệu tham khảo, [α]D = - 363,6 (c 0,2; CH3OH) [32]. Tuy nhiờn, để khẳng định thờm chỳng tụi sử dụng phương phỏp HPLC để đỏnh giỏ thụng qua dẫn xuất bazơ Schiff của sản phẩm (-) -gossypol với amine bất đối (R)-(-)-2-amino-1-propanol theo phương phỏp của Robert D. Stipanovic và cộng sự [51]. OH CHO HO HO OH CHO OH OH OH HO HO OH OH N N OH OH (R)-2-amino-1-propanol CH3CN, 25°C, tránh ánh sáng môi tr ờng khí nitơ (±)-Gossypol (±)-Gossypol-(R)-2-amino-1-propanol OH HO NH2
Kết quả phõn tớch trờn HPLC cho thấy dẫn xuất bazơ Schiff của (-)-gossypol- (R)-2-amino-1-propanol cho một pic chớnh (86% diện tớch cỏc pic ở 254 nm) cú thời gian lưu là 8,17 phỳt (Hỡnh 3.11, Phụ lục 15). Trong khi đú, dẫn xuất (+)-gossypol- (R)-2-amino-1-propanol cho một pic chớnh (67% tổng diện tớch pic ở 254 nm) cú thời gian lưu tương ứng là 4,83 phỳt (Hỡnh 3.12, Phụ lục 16). Mặt khỏc, trờn sắc ký đồ HPLC của sản phẩm (-)-gossypol, tại thời gian lưu 4,83 phỳt (thời gian lưu đặc trưng của (+)-gossypol-(R)-2-amino-1-propanol) chỉ thấy một pic rất nhỏ (<1%), chứng tỏ sản phẩm (-)-gossypol phõn lập được chỉ lẫn một lượng rất nhỏ (+)- gossypol. Do đú, bước đầu cú thể khẳng định sản phẩm (-)-gossypol phõn tỏch được cú độ tinh khiết quang học khỏ cao được thể hiện bằng diện tớch cỏc pic của bazơ Schiff tương ứng trờn HPLC. Tương tự, trờn sắc ký đồ HPLC sản phẩm tạo base Schiff của (+)-gossypol, tại thời gian lưu 8,17 phỳt (thời gian lưu đặc trưng của (-)- gossypol-(R)-2-amino-1-propanol), chỉ thấy một pic rất nhỏ (<1%), chỳng tỏ sản phẩm (+)-gossypol mà chỳng tụi phõn lập được chỉ lẫn một lượng rất nhỏ (-)- gossypol. Do đú, bước đầu cú thể khẳng định sản phẩm (+)-gossypol phõn tỏch được cũng cú độ tinh khiết quang học khỏ cao. Điều này cũn chứng tỏ hiệu quả của quỏ trỡnh phõn tỏch hai đồng phõn diastereomer tương ứng của nú qua sắc ký cột và hơn nữa là nú đó chứng tỏ rằng khụng cú quỏ trỡnh racemic hoỏ của (-)-gossypol trong quỏ trỡnh phõn lập (trong mụi trường acid khi thuỷ phõn bazơ Schiff hay trong quỏ trỡnh tinh chế qua sắc ký cột sillica gel).
Hỡnh 3.12. Sắc ký đồ HPLC của bazơ Schiff (+)-gossypol-(R)-2-amino-1-propanol.
(+)-gossypol-(R)-2-amino-1-propanol cú t=4,83 phỳt, S=67% (254 nm)
Kết quả phõn tớch trờn HPLC cho thấy cả 2 đồng phõn (-)-gossyol và (+)- gossyol tỏch được đều cú độ tinh khiết quang học khỏ cao, tuy nhiờn sản phẩm (-) -gossypol cú độ tinh khiết húa học cao hơn (chiếm 91% tổng diện tớch pic), trong khi đú sản phẩm (+)-gossypol cú độ tinh khiết húa học thấp hơn (79,2%). Điều này khỏ phự hợp với giỏ trị độ quay cực của cỏc sản phẩm này, [α]D = + 3270 với (+)-gossyol và [α]D = - 3680 đối với (-)-gossyol.
Đó cú nhiều nghiờn cứu phõn tỏch cỏc đồng phõn quang học gossypol thụng qua việc tạo bazơ Schiff với cỏc amine bất đối. Đồng phõn quang học (+)- và (-)-gossypol từ hỗn hợp (±) gossypol cú thể được phõn tỏch khi sử dụng (-)- norepinephrine hoặc (-)-epinephrine. Tuy nhiờn sản phẩm bazơ Schiff của gossypol với cỏc amine này lại kộm tan trong cỏc dung mụi hữu cơ hơn là sản phẩm bazơ Schiff của gossypol với L-phenylalaninol. Hơn nữa, cú thể xảy ra quỏ trỡnh racemic húa ở cỏc amine này khi nguyờn tử cacbon bất đối xứng liền kề với nhúm aldimine trong cấu trỳc của bazơ Schiff [47]. L-phenylalanine methyl ester cũng đó được Matlin A. và cộng sự sử dụng để phõn tỏch cỏc đồng phõn quang học của gossypol. Cỏc đồng phõn diastereomer bazơ Schiff tạo thành của gossypol với amine này được phõn tỏch bằng sắc ký cột. Tuy nhiờn, hiệu suất phõn tỏch chỳng qua cột lại rất thấp (60% và 15% tương ứng với dẫn xuất bazơ Schiff của (-)-gossypol và (+)-gossypol) do sự kộo dài đuụi của dẫn xuất bazơ Schiff (-)-gossypol trong quỏ trỡnh chạy cột [36]. Oliver C. L. và cộng sự, khi sử dụng L-phenylalanyl methyl ester đó tỏch được (-)-gossypol và (+)-gossypol với
Sampatk D. S. và cộng sự đó sử dụng L-phenylalaninol để phõn tỏch đồng phõn quang học gossypol. Tuy nhiờn, (±)-gossypol-L-phenylalaninol dienamine được cỏc tỏc giả phõn tỏch bằng cỏch sử dụng HPLC với cột pha đảo C18 rồi thủy phõn bằng HCl. Phương phỏp này cú hiệu quả cao, cú thể thu được cỏc đồng phõn với độ tinh khiết quang học cao ([α]D: +373" (c 0.468, CHC13) và [α]D: +373" (c 0.468, CHC13) tương ứng với (+)-gossypol và (-)-gossypol) và hiệu suất khoảng 50-60% [47]. Nhưng phải sử dụng thiết bị hiện đại là HPLC nờn chi phớ cao và khú tiến hành ở quy mụ lớn. Dựa trờn kết quả của nghiờn cứu trờn, chỳng tụi đó sử dụng L-phenylalaninol để tạo base Schiff tương ứng. (±)-Gossypol-L- phenylalaninol dienamine tạo thành được chỳng tụi phõn tỏch với hiệu xuất cao (95% với (-)-gossypol-L-phenylalaninol dienamine và đạt 83,9% đối với (+)- gossypol-L-phenylalaninol dienamine) mà khụng sử dụng phương phỏp HPLC với cột pha đảo mà chỉ bằng phương phỏp sắc ký cột trờn silica gel pha thường. Tớnh cả giai đoạn thủy phõn cỏc bazơ Schiff, toàn bộ quỏ trỡnh phõn tỏch này chỳng tụi thu được với hiệu suõt khỏ cao (66,7% với (+)-gossypol và 82,1% với (-)-gossypol).