5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA LUẬN ÁN
1.3. TỔNG QUAN VỀ OLEANOLIC ACID
1.3.1. Vai trò và phân bố
Oleanolic acid là một hợp chất thứ cấp được tổng hợp trong nhiều loại thực vật khác nhau. Chúng đóng vai trò như các chất phòng vệ chống lại các loài động vật ăn cỏ hoặc mầm bệnh, có liên quan đến sự hình thành các rào cản chống mất nước, hay có đặc tính allelopathic. Tính đến 9/2007, oleanolic acid đã được phát hiện có mặt trong 146 họ, 698 chi và 1620 loài thực vật, đặc biệt là họ Oleaceae [122]. Các pentacyclic triterpene bao gồm oleanolic acid được phổ biến rộng rãi trong các loại quả, lá và vỏ của các loại cây ăn được và cây dược liệu khác nhau. Loài Lantana camara và Ligustrum
lucidum là những nguồn giàu oleanolic acid và chúng được sử dụng trong y
học truyền thống để điều trị các bệnh khác nhau. Oleanolic acid cũng có thể dễ dàng thu được với năng suất cao từ cây ô liu. Guinda và cs (2010) đã thông báo rằng thành phần triterpene trong lá của cây ô liu rất đa dạng, trong đó oleanolic acid là triterpenoid phong phú nhất trong các giống được khảo sát. Các loại gia vị ẩm thực phổ biến như cỏ xạ hương và cây đinh hương cũng là nguồn cung cấp oleanolic acid. Táo, nho, cây sơn trà, cây xô thơm là một số cây ăn quả, trong đó oleanolic acid cũng đã được phát hiện và phân lập [26].
1.3.2. Một số công dụng của oleanolic acid
Oleanolic acid và đồng phân của nó đã được chứng minh có các hoạt tính sinh học như khả năng chống viêm, bảo vệ gan, kháng khối u, kháng khuẩn, kháng nấm, ức chế virus, ... Một số có tác dụng trong điều trị viêm loét dạ dày, viêm da. Hiện nay, nhiều nghiên cứu cũng cho thấy, oleanolic acid và urnolic acid có tác dụng trong điều trị tiểu đường, chống cao huyết áp [64, 108].
26
1.3.2.1. Hoạt tính kháng khuẩn
Khả năng kháng khuẩn của oleanolic acid và ursolic acid đã được khảo sát với nhiều chủng vi khuẩn khác nhau. Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy, oleanolic acid và ursolic acid có hoạt tính kháng khuẩn phổ rộng, trong đó chủ yếu là các vi khuẩn Gram âm, do đó hai hợp chất này đóng vai trò quan trọng trong nhiều loại thuốc kháng sinh. Oleanolic và ursolic acid đã được chứng minh có khả năng kháng lại nhiều chủng vi khuẩn gây bệnh ở người khác như S. pneumonia (MIC 16 𝜇g/mL), các chủng Staphylococcus aureus
nhạy và kháng methicillin (tương ứng với giá trị MIC ở 8 𝜇g/mL và 64
𝜇g/mL) [121], Bacillus subtilis (MIC 8 𝜇g/mL), B. cereus, Enterococcus
faecalis (MIC 6,25-8,00 𝜇g/mL), E. faecium (MIC 8 𝜇g/mL), và
Pseudomonas aeruginosa (MIC 256 𝜇g/mL) [39, 48].
1.3.2.2. Tác dụng bảo vệ gan
Tác dụng bảo vệ gan của oleanolic acid được công bố lần đầu tiên vào năm 1975 trong nghiên cứu của He và Shi trên cây Swertia mileensis, một loại dược liệu truyền thống được sử dụng trong điều trị viêm gan. Ba hoạt chất được phân lập từ loài dược liệu này, trong đó có oleanolic acid cho hiệu quả tốt nhất trong bảo vệ chống lại tổn thương gan gây ra bởi tác nhân CCl4. Các nghiên cứu sau đó cũng đã chứng minh thêm oleanolic acid có khả năng làm suy giảm CCl4 - chất gây ra hoại tử mô gan cũng như xơ và thoái hóa gan [71].
1.3.2.3. Tác dụng kháng viêm
Tác dụng kháng viêm là hoạt tính phổ biến của nhiều loại triterpenoid. Hoạt tính kháng viêm của oleanolic acid được báo cáo lần đầu tiên bởi Gupta và cs (1969) dựa trên nghiên cứu cho thấy, oleanolic acid phân lập từ tảo biển bởi sự hình thành aldehyde kháng lại sự phù nề và viêm khớp ở chân chuột. Các nghiên cứu sau này cũng đã chứng minh tác dụng kháng viêm của oleanolic acid [105, 110].
27
1.3.2.4. Hoạt tính kháng khối u
Nhiều nghiên cứu cho thấy, quá trình hình thành và phát triển của khối u bị ngăn chặn bởi oleanolic acid và ursolic acid với nhiều mức độ khác nhau. Trong đó, tác động đáng chú ý nhất của 2 loại triterpenoid nói trên là tác động kìm hãm sự sinh trưởng của khối u. Oleanolic acid và ursolic acid được xác định là các hoạt chất chính được tìm thấy trong cây Ligustrum lucidum. Hai hoạt chất này giúp ngăn chặn quá trình đột biến hình thành bởi sự benzo[a]pyrene (B[a]P) của vi khuẩn [87].
1.3.2.5. Hoạt tính chống bệnh tiểu đường
Tiểu đường là một căn bệnh tiến triển phức tạp, kết quả của sự bài tiết hay khả năng cảm ứng tổng hợp insulin bị suy giảm. Oleanolic acid đã được sử dụng làm tác nhân trị liệu trong các mô hình bệnh tiểu đường để cải thiện hoạt động của insulin, ức chế sự tổng hợp glucose và thúc đẩy sử dụng glucose. Oleanolic acid không gây tích lũy mỡ (adipogenic), không giống như các liệu pháp điều trị tiểu đường thường được sử dụng như insulin hoặc thiazolidinediones điều hòa vận chuyển glucose ở ngoại biên và thường dẫn đến tăng cân. Vì vậy, oleanolic acid có thể là một phương thức điều trị đầy hứa hẹn và tốt hơn so với các tác nhân trị liệu chống tiểu đường khác [26].
1.3.2.6. Hoạt tính chống oxy hóa
Stress oxy hóa được biết đến có liên quan đến các yếu tố gây bệnh của các bệnh mãn tính khác nhau và do đó liệu pháp chống oxy hóa là một chiến lược đầy hứa hẹn cho việc quản lý và điều trị các bệnh này (Bajpai, 2016). Các báo cáo về hoạt tính sinh học của oleanolic acid đôi khi được cho là do tác dụng chống oxy hóa của nó. Ví dụ, oleanolic acid từ L. lucidum đã được chứng minh là làm giảm mức độ malonaldehyde (MDA) và tăng hoạt tính superoxide dismutase (SOD) và gluthatione peroxidase (GSH-px) trên chuột bị bệnh tiểu đường do alloxan gây ra. Mức độ MDA (dựa theo sản phẩm của quá trình peroxide lipid), hoạt động của SOD và GPX (enzyme chống oxy hóa
28
chính) là yếu tố quan trọng quyết định tình trạng chống oxy hóa trong các mô động vật có vú. Tương tự, trong một nghiên cứu in vitro, oleanolic acid tăng sản xuất glutathione và sự biểu hiện của các enzyme chống oxy hóa quan trọng. Một số nghiên cứu cho thấy, oleanolic acid phân lập thể hiện tính chất chống oxy hóa có thể so sánh được với các tác nhân chống oxy hóa thương mại [26].
1.3.3. Cấu trúc hóa học và tính chất vật lý
Oleanolic acid là một sapogenin triterpen có công thức phân tử là C30H48O3 (Hình 1.1). Tên khoa học: (3β)-Hydroxyolean-12-en-28-oic. Phân tử lượng: 456,711 g/mol [76].
Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của oleanolic acid [95].
Oleanolic acid (OA) (3β-hydroxy-olea-12-en-28-oic acid) và đồng phân của nó, ursolic acid (UA) (3β-hydroxy-urs-12-en-28-oic acid), là các hợp chất triterpenoid tồn tại trong nhiều loại thực vật ở dạng acid tự do hoặc dạng aglycone của saponin triterpenoid loại ursane và oleanane [54], với 30 nguyên tử carbon hoặc dẫn xuất của chúng. Các cấu trúc khung thường thấy là oleanan pentacyclic (saponin triterpenoid 5 vòng) và dammaran tetracyclic (saponin triterpenoid 4 vòng). Oleanane và ursane còn được gọi là β-amyrane và α-amyrane [76]. Oleanolic acid tinh chất tồn tại ở dạng bột kết tinh màu trắng, không tan trong nước, tan trong 65 phần
29
ether, 108 phần alcohol 95%, 35 phần alcohol 95% sôi, 118 phần chloroform, 118 phần acetone, 235 phần methanol. Nhiệt độ nóng chảy 310оC, góc quay cực bằng +83,3о, Ka = 2,52 [76].
1.3.4. Sinh tổng hợp oleanolic acid
Oleanolic acid và đồng phân của nó ursolic acid được tổng hợp bằng cách gấp nếp và xâu chuỗi của squalene dẫn đến tạo thành hệ thống vòng dammarenyl với cấu trúc lập thể và cấu trúc vòng hơi khác so với các loại sterol. Tiếp theo, các dammarenyl trải qua quá trình mở rộng vòng và đóng vòng để tạo thành vòng thứ 5 đặc trưng được tìm thấy trong cấu trúc của lupeol, khung α-amyrin (2) và β-amyrin (3). Oleanolic acid chứa bộ khung β- amyrin và urnolic acid chứa bộ khung α-amyrin (Hình 1.2 và 1.3) [27].
Hình 1.2. Sinh tổng hợp cation dammarenyl (I), oleanyl, lupenyl và lupeol từ squalene [27].
30
Hình 1.3. Sinh tổng hợp UA (4) và OA (5) từ cation oleanyl [27].
Hình 1.4. Chu trình tổng hợp oleanolic acid ở thực vật [95]. bAS: β-amyrin synthase, CAS: cycloartenol synthase, IPP: isopentenyl pyrophosphate.
31
Theo Pollier và cs (2012), oleanolic acid được tổng hợp từ tiền chất 2,3- oxidosqualene, chất này dưới xúc tác của β-amyrin synthase (bAS) sẽ tạo nên β-amyrin, sau đó enzyme cytochrome P450 (CYP716A) chuyển hóa β-amyrin thành erythrodiol, và erythrodiol biến đổi thành oleanolic acid (Hình 1.4) [95]. Các enzyme thuộc phân họ CYP716A đã được công bố là có liên quan đến quá trình sinh tổng hợp triterpenoid. Các enzyme này oxy hóa các vị trí khác nhau dọc theo khung carbon của triterpenoid và phần lớn chúng xúc tác quá trình oxy hóa ba bước ở vị trí C-28. Quá trình oxy hóa C-28 diễn ra trong quá trình sinh tổng hợp oleanolic acid, ursolic acid và betulinic acid [109].
1.3.5. Các nghiên cứu sản xuất oleanolic acid bằng nuôi cấy mô và tế bào thực vật thực vật
1.3.5.1. Sản xuất oleanolic acid từ nuôi cấy callus
Oleanolic acid có thể được tổng hợp từ nhiều loài cây khác nhau, vì vậy, nuôi cấy callus từ nhiều loài cây khác nhau để thu nhận oleanolic acid cũng đã được quan tâm nghiên cứu. Khả năng tổng hợp oleanolic acid và ursolic acid từ nuôi cấy callus loài Salvia tomentosa Mill đã được Georgiev và cs (2014) thông báo. Các dòng callus thu được cho thấy sự thay đổi lớn trong tiềm năng sinh tổng hợp của chúng. Nguyên nhân là do sự đa bội thể của tế bào thực vật trong các mô callus được tác động bởi các chất điều hòa sinh trưởng sử dụng trong cảm ứng tạo callus. Một dòng bát bội thể (octaploid) bao gồm các tế bào 8C, 16C và 32C được lựa chọn làm nguồn sản xuất oleanolic acid và ursolic acid với hàm lượng thu được tương ứng là 991,57 μg/g khối lượng khô và 641,85 μg/g khối lượng khô [41].
Nuôi cấy callus có xử lý elicitor để thu nhận oleanolic acid cũng đã được nhiều tác giả nghiên cứu và công bố. Zhao và cs (2013) tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của các elicitor đến khả năng tích lũy oleanolic acid và sự biểu hiện của các gen tổng hợp triterpenoid trong nuôi cấy callus loài Gentiana
32
tích lũy oleanolic acid và cả hai yếu tố nhiệt độ thấp và bức xạ UV-B làm thay đổi biểu hiện của các gen tổng hợp triterpenoid. Tuy nhiên, sử dụng MeJA đã tăng cường đáng kể lượng oleanolic acid tích lũy và điều hòa gen tổng hợp triterpenoid, đặc biệt lá sự biểu hiện của βAS, gen mã hóa β-amyrin [127]. Ảnh hưởng của MeJA và SA đến khả năng sản xuất oleanolic acid và ursolic trong nuôi cấy callus Lepechinia caulescens đã được Martínez và cs (2017) nghiên cứu. Môi trường nuôi cấy có bổ sung 3,0 mg/L 2,4-D và 0,1 mg/L BAP cảm ứng tạo callus và sản xuất ursolic acid và oleanolic acid mạnh nhất với hàm lượng tương ứng là 1,57 mg/g và 1,13 mg/g khối lượng khô. Các elicitor được bổ sung trong quá trình nuôi cấy làm thay đổi khả năng tích lũy oleanolic và ursolic acid; trong đó, MeJA 50 μM cho kết quả tốt nhất với hàm lượng ursolic acid tăng gấp 5,6 lần và oleanolic acid tăng gấp 4,7 lần so với đối chứng sau 8 giờ xử lý elicitor [75].
1.3.5.2. Sản xuất oleanolic acid từ nuôi cấy huyền phù tế bào
Đến nay, nhiều đối tượng thực vật đã được nuôi cấy tế bào để sản xuất oleanolic acid. Haas và cs (2014) thiết lập được hệ thống sản xuất oleanolic acid và ursolic acid bằng nuôi cấy huyền phù tế bào các loài Salvia spp. Mười một dòng callus từ các loài Salvia officinalis, S. virgata và S. fruticosa đã được chọn lọc để xây dựng hệ thống nuôi cấy huyền phù. Sau quá trình nuôi cấy được thực hiện thành công và được tiến hành trong hệ thống giám sát hoạt động hô hấp (RAMOS®) để thu thập dữ liệu trực tiếp về động học sinh trưởng của chúng và thiết lập lịch trình thu mẫu thích hợp để xác định thời điểm sản xuất oleanolic acid và ursolic acid. Dựa trên đường cong sinh trưởng, thành phần oleanolic acid và ursolic acid và các đặc tính tổng hợp, một hệ thống nuôi cấy huyền phù từ mỗi loài Salvia nghiên cứu đã được chọn để tối ưu hóa thêm. Giá trị µmax trong các hệ thống nuôi cấy này dao động từ 0,20 đến 0,37/ngày, hàm lượng oleanolic acid và ursolic acid của chúng lớn hơn 1,3 và 1,2 mg/g tương ứng và chúng tạo ra hiệu suất tối đa là 21 mg/L cho oleanolic
33
acid và 32,8 mg/L cho ursolic acid [42]. Cyclocarya paliurus là một loài thực vật chỉ có ở miền trung Trung Quốc với các tác dụng hạ đường huyết và giảm mỡ máu. Để sử dụng tốt hơn nguồn tài nguyên thực phẩm chức năng này, nuôi cấy tế bào C. paliurus và tích lũy triterpenic acid đã được Yin và cs (2013) nghiên cứu. Huyền phù tế bào đồng nhất và ổn định thu được trên môi trường cơ bản MS có bổ sung 0,5 mg/L 2,4-D, 0,3 mg/L NAA và cytokinin. Hàm lượng triterpenic acid tổng số, ursolic và oleanolic acid trong các tế bào nuôi cấy huyền phù cao hơn đáng kể so với trong lá và callus, với mức tăng lên đến 6,24, 2,28 và 0,94% (khối lượng khô). Hàm lượng betulinic acid của tế bào nuôi cấy huyền phù cũng đạt 0,82%, cao hơn đáng kể so với trong nuôi cấy callus. Những kết quả này cho thấy, rằng nuôi cấy huyền phù tế bào C.
paliurus cho hàm lượng triterpenic acid tích lũy cao và có thể được sử dụng
để sản xuất triterpenic, ursolic, oleanolic và betulinic acid [125].
Để cải thiện khả năng sinh tổng hợp oleanolic trong nuôi cấy tế bào, nhiều nghiên cứu đã sử dụng elicitor để kích hoạt quá trình chuyển hóa thứ cấp ở thực vật. Kumar và cs (2015) khảo sát ảnh hưởng của các elicitor khác nhau đến khả năng sản xuất oleanolic, ursolic và betulinic acid trong nuôi cấy huyền phù loài L. camara. Xử lý bằng nấm Piriformospora indica với nồng độ 2,5% (v/v) cho kết quả sản xuất các hợp chất triterpenoid ở mức cao nhất, nồng độ ursolic acid tăng gấp 3,5 lần (3869,3 µg/g khối lượng khô), oleanolic acid gấp 5,6 lần (1425,7 µg/g khối lượng khô) và betulinic acid gấp 7,8 lần (117,02 µg/g khối lượng khô) [58]. Arican (2016) đã nghiên cứu ảnh hưởng của các loại elicitor sinh học đến khả năng tổng hợp triterpene trong nuôi cấy tế bào Alstonia scholaris. Quá trình nuôi cấy được xử lý với các loại nấm
Candida albicans, F. oxysporum, Penicillium avelanium và Saccharomyces
cerevisiae. Các elicitor này đã gây ra sự kích thích nhanh chóng quá trình trao
đổi chất thứ cấp của các tế bào A. scholaris dẫn đến tăng sinh tổng hợp triterpenoid. Khi tiếp xúc trong thời gian dài, một số dòng tế bào có khả năng
34
tăng gấp đôi sản lượng của triterpenes. S. cerevisiae là elicitor tốt nhất với hàm lượng ursolic acid và oleanolic acid tích lũy tương ứng đạt 5 và 7 mg/g khối lượng khô [25]. Nuôi cấy huyền phù tế bào Kalopanax septemlobus đã được Lee và cs (2018) thực hiện nhằm phát triển một hệ thống sản xuất bền vững và ổn định các hợp chất saponin. Lượng saponin tối đa (1,56 mg/60 mL) tích lũy được sau 15 ngày nuôi cấy. Khi bổ sung coronatine 1 μM vào quá trình nuôi cấy, lượng saponin tích lũy tăng lên 160% so với đối chứng. Ngoài ra, các tác giả nhận thấy, coronatine làm tăng biểu hiện enzyme β-amyrin synthase từ đó dẫn đến tăng tích lũy oleanolic acid với hàm lượng 2,37 µg/mg chiết xuất [89].
1.3.5.3. Sản xuất oleanolic acid từ nuôi cấy rễ tơ
Hệ thống nuôi cấy rễ tơ (hairy root) hiện nay đã trở nên phổ biến và được sử dụng như một phương thức có nhiều tiềm năng để sản xuất các chất chuyển hóa thứ cấp. Rễ tơ là các rễ đột biến trong quá trình nuôi cấy biệt hóa, được tạo ra bởi sự lây nhiễm A. rhizogenes vào các loài thực vật bậc cao tại các vị trí bị tổn thương. Tác nhân gây bệnh này gây ra sự phát triển các khối u của rễ được đặc trưng bởi tốc độ sinh trưởng cao trong môi trường không chứa hormone và có sự ổn định di truyền khi nuôi cấy trong một thời gian dài. Rễ tơ có con đường tổng hợp các hợp chất cũng giống với ở các cơ quan tự nhiên nhưng lại cho năng suất cao hơn nhiều lần [90], [94]. Dlugosz và cs (2013) đã tiến hành sản xuất oleanolic acid bằng nuôi cấy rễ tơ loài Calendula
officinalis. Lá mầm hay trụ dưới lá mầm thu từ cây in vitro được gây nhiễm
với chủng A. rhizogenes ATCC 15834 (đối chứng) hoặc cùng chủng có chứa vector pCAMBIA 1381Z mang gene mã hóa β-glucuronidase dưới sự kiểm soát của promoter của gen NIK cà chua (nematode induced kinase). Hiệu quả