5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA LUẬN ÁN
3.3.2. Ảnh hưởng của methyl jasmonate
3.3.2.1. Sinh trưởng tế bào
Bổ sung MeJA với các nồng độ 10, 50 và 100 µM vào môi trường vào thời điểm ban đầu và sau 3 đến 9 ngày nuôi cấy cho thấy tế bào huyền phù
A B C
71
đinh lăng lá nhỏ có sự sinh trưởng khác nhau (Bảng 3.11, Hình 3.11 và 3.12).
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của MeJA lên sinh trưởng của tế bào đinh lăng lá nhỏ. MeJA (µM) Thời điểm (ngày)
Khối lượng tế bào
(g/bình) GI Trạng thái Tươi Khô 10 0 4,39c 0,36b 2,20c Vàng xanh, cứng 3 4,56c 0,36b 2,28c Vàng xanh, cứng 6 4,99b 0,39a 2,49b Vàng, cứng 9 6,18a 0,41a 3,09a Vàng xanh, cứng 50 0 3,70c 0,34b 1,85cd Vàng, cứng 3 4,67bc 0,35b 2,34bc Vàng xanh, cứng 6 5,10b 0,40a 2,55b Vàng, cứng 9 5,65ab 0,40a 2,83ab Vàng xanh, cứng 100 0 2,16d 0,28c 1,08d Vàng nâu, cứng 3 4,09c 0,35b 2,05c Vàng, cứng 6 4,81bc 0,39a 2,40bc Vàng, cứng 9 5,14b 0,39a 2,57b Vàng xanh, cứng
Các chữ cái khác nhau trên cùng một cột chỉ ra sự sai khác có mức ý nghĩa thống kê của trung bình mẫu với p<0,05 (Duncan’s test).
Khi được bổ sung vào thời điểm ban đầu, tất cả nồng độ khác nhau của MeJA đều ức chế sinh trưởng tế bào đinh lăng lá nhỏ. Sinh khối tươi của chúng giảm nhiều (chỉ đạt 2,16-4,39 g/bình) so với đối chứng là 6,37 g/bình (Bảng 3.9). Tuy nhiên, sinh khối khô thay đổi không đáng kể (0,28-0,36 g/bình) so với đối chứng 0,39 g/bình (Bảng 3.9 và 3.11). Nhìn chung, nồng độ MeJA bổ sung vào môi trường càng cao thì sinh trưởng tế bào càng giảm. Về trạng thái tế bào, khi xử lý nồng độ MeJA càng cao, tế bào càng có xu hướng
72
hóa nâu và cứng hơn, chỉ số sinh trưởng thấp hơn ở các nồng độ MeJA thấp. Số liệu ở bảng 3.11 cũng cho thấy, thời điểm bổ sung MeJA đã ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng của tế bào đinh lăng lá nhỏ. Tại các thời điểm 3, 6 và 9 ngày, sinh trưởng tế bào đều cao hơn so với thời điểm bổ sung lúc bắt đầu nuôi cấy. Ở tất cả các nồng độ xử lý, bổ sung vào thời điểm 9 ngày sau khi nuôi cấy gây ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của tế bào ít nhất, tất cả các chỉ số sinh trưởng, khối lượng tươi, khối lượng khô đều đạt cao nhất, gần bằng đối chứng không xử lý elicitor. Trong từng thời điểm xử lý elicitor, nồng độ MeJA càng cao ức chế sinh trưởng tế bào càng lớn, tuy nhiên, sự khác nhau khi xử lý ở thời điểm 6 ngày và 9 ngày không có ý nghĩa thống kê ở các nồng độ xử lý cao (50-100 µM).
Như vậy, tương tự YE, thời gian tế bào được cảm ứng với MeJA càng ngắn thì sinh trưởng của tế bào càng cao và ngược lại, tế bào sinh trưởng kém khi thời gian tế bào được cảm ứng dài (bổ sung elicitor lúc bắt đầu nuôi cấy).
3.3.2.2. Hàm lượng oleanolic acid
Để khảo sát ảnh hưởng của MeJA lên khả năng tích lũy oleanolic acid của tế bào đinh lăng lá nhỏ, MeJA đã được bổ sung vào môi trường nuôi cấy với các nồng độ và thời điểm khác nhau, sau đó thu kết quả vào ngày thứ 16 (Bảng 3.12).
Kết quả khảo sát cho thấy, khi bổ sung MeJA vào môi trường nuôi cấy, hầu hết các công thức thí nghiệm đều có hàm lượng oleanolic acid cao hơn so với đối chứng không xử lý elicitor. Ở nồng độ 10 µM, thời điểm bổ sung MeJA tốt nhất là sau 6 ngày nuôi cấy, hàm lượng oleanolic acid thu được cao gấp 3,8 lần đối chứng (38,03 mg/bình) (Bảng 3.12).
73
Bảng 3.12. Ảnh hưởng của MeJA lên tích lũy oleanolic acid của tế bào đinh lăng lá nhỏ.
MeJA (µM)
Thời điểm bổ sung (ngày nuôi
cấy) Hàm lượng oleanolic acid (mg/g khô) Hàm lượng oleanolic acid (mg/bình) Tăng so với đối chứng (lần) ĐC 25,40e 9,86e 1,00 10 0 45,21d 16,37d 1,78 3 60,96c 22,13c 2,40 6 96,52b 38,03b 3,80 9 71,88bc 29,62b 2,83 50 0 89,15b 30,22b 3,51 3 97,79b 34,42b 3,85 6 87,88b 35,24b 3,46 9 15,75e 6,31d 0,62 100 0 49,02d 13,58de 1,93 3 131,83a 45,48a 5,19 6 68,83c 26,50bc 2,71 9 64,01c 24,84c 2,52
ĐC: đối chứng không bổ sung elicitor
Ở môi trường có 50 µM, hàm lượng oleanolic acid tích lũy cao hơn đối chứng khoảng hơn 3,5 lần khi được bổ sung trong khoảng thời gian 0-6 ngày nuôi cấy, trong khi bổ sung vào thời điểm 9 ngày lại cho kết quả thấp hơn đối chứng, chứng tỏ thời gian không còn đủ cho quá trình sinh tổng hợp oleanolic acid. Công thức cho kết quả tích lũy oleanolic acid trong tế bào cao nhất là bổ sung 100 µM MeJA vào thời điểm 3 ngày sau khi nuôi cấy, oleanolic acid được tích lũy cao hơn đối chứng khoảng 5 lần (45,48 mg/bình) (Bảng 3.12).
74
Hình 3.11. Dịch huyền phù tế bào (A), sinh khối tươi (B) và sinh khối khô (C) của tế bào huyền phù đinh lăng lá nhỏ trong môi trường cơ bản MS có 20 g/L sucrose; 1 mg/L BAP; 0,5 mg/L 2,4-D bổ sung MeJA 10 µM lúc bắt đầu nuôi cấy.
Hình 3.12. Dịch huyền phù tế bào (A), sinh khối tươi (B) và sinh khối khô (C) của tế bào huyền phù đinh lăng lá nhỏ trong môi trường cơ bản MS có 20 g/L sucrose; 1mg/L BAP; 0,5 mg/L 2,4-D bổ sung MeJA 100 µM sau 3 ngày nuôi cấy.
Như vậy, nồng độ cũng như thời điểm bổ sung MeJA và YE vào môi trường nuôi cấy đều có ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và tích lũy oleanolic acid của tế bào huyền phù đinh lăng lá nhỏ. Việc bổ sung elicitor vào quá trình nuôi cấy tế bào đinh lăng lá nhỏ đã giúp cải thiện khả năng tích lũy oleanolic acid trong tế bào. Trong đó, YE có hiệu quả cao hơn so với MeJA (YE tăng 6,47 lần trong khi MeJA tăng 5,19 lần). Do đó, bằng phương pháp này có thể sản xuất một lượng lớn oleanolic acid trong thời gian ngắn thay vì phải thu từ cây tự nhiên lâu năm.
A B C
75
Chương 4 BÀN LUẬN