5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA LUẬN ÁN
2.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên khả năng sinh trưởng
trưởng của callus
2.2.2.1. Ảnh hưởng của 2,4-D và KIN
Callus (0,3 × 0,3 cm) có nguồn gốc từ lá, thân và rễ của cây đinh lăng lá
nhỏ in vitro được nuôi trên môi trường cơ bản MS bổ sung 2,4-D có nồng độ
từ 0,5-3 mg/L và 0,5 mg/L KIN để thăm dò khả năng sinh trưởng của callus [17, 21]. Đối chứng là công thức nuôi cấy không bổ sung KIN và 2,4-D. Số liệu được thu sau 5 tuần nuôi cấy, từ đó rút ra nồng độ 2,4-D và KIN tối ưu cho các nghiên cứu tiếp theo.
Mẫu thí nghiệm được cấy trong các bình tam giác có thể tích 250 mL (hoặc bình serum) chứa 50 mL môi trường rắn, đặt trong phòng nuôi cấy có nhiệt độ 25±2oC, cường độ chiếu sáng 2.000 lux, thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày [67]. Số lượng callus/bình dao động từ 10-12 mẫu.
Sinh trưởng của callus được đánh giá dựa trên kích thước khối callus (đường kính), khối lượng tươi và khối lượng khô. Trạng thái vật lý của callus được xác định bằng đánh giá cảm quan. Callus sinh trưởng tốt nhất được dùng làm nguyên liệu cho các thí nghiệm nuôi cấy huyền phù.
Đường kính callus: được đo bằng thước kẹp.
Khối lượng tươi (FW): Khối callus được loại bỏ agar, cân để xác định khối lượng tươi.
Khối lượng khô (DW): Sau khi cân khối lượng tươi, callus được sấy khô ở 50oC đến khối lượng không đổi, cân để xác định khối lượng khô [67].
Chỉ số sinh trưởng (GI) được tính bằng tỷ lệ giữa khối lượng tươi sau một thời gian nuôi cấy (g) và khối lượng tươi lúc đưa vào nuôi cấy (g).
2.2.2.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ
47
nhất, có các đặc điểm hình thái thích hợp để nuôi cấy tế bào huyền phù sẽ được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.
Mẫu callus (0,3 × 0,3 cm) được cấy lên môi trường cơ bản MS chứa các chất điều hòa sinh trưởng ở điều kiện tối ưu, bổ sung dịch tryptone (0,2-1,6 g/L) hoặc casamino acids (0,2-1,6 g/L) để thăm dò khả năng sinh trưởng của callus [21]. Số lượng callus/bình dao động từ 10-12 mẫu. Đối chứng là công thức nuôi cấy không bổ sung tryptone hoặc casamino acids. Số liệu được thu sau 5 tuần nuôi cấy.
2.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên khả năng sinh trưởng của tế bào trưởng của tế bào
Callus có màu vàng, rời rạc, 30 ngày tuổi từ công thức nuôi cấy tốt nhất được sử dụng cho các nghiên cứu nuôi cấy huyền phù tế bào. Mẫu thí nghiệm được cấy trong các bình tam giác có thể tích 250 mL chứa 50 mL môi trường lỏng, đặt trong phòng nuôi cấy có nhiệt độ 25±2oC, cường độ chiếu sáng 500 lux, tốc độ lắc 120 vòng/phút và thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày [67]. Mỗi công thức thí nghiệm gồm 5 bình.
* Xây dựng đường cong sinh trưởng của tế bào: 2 g callus được cấy chuyển và nuôi trong bình tam giác chứa môi trường cơ bản MS lỏng (môi trường nuôi cấy tạo callus tốt nhất nhưng không có agar) với 30 g/L sucrose. Tế bào được thu liên tục 2 ngày/lần trong thời gian từ 2-22 ngày, khả năng sinh trưởng của tế bào được xác định qua khối lượng tươi, khối lượng khô và chỉ số sinh trưởng của tế bào [86].
Thu mẫu: dịch nuôi cấy tế bào huyền phù được lọc chân không, rửa sạch sinh khối bằng nước cất 2-3 lần sau đó được sử dụng làm nguyên liệu để đánh giá các chỉ tiêu liên quan.
48
bằng giấy lọc, rửa bằng nước cất và cân để xác định khối lượng tươi.
Khối lượng khô (DW): callus được sấy khô ở 50oC đến khối lượng không đổi, cân để xác định khối lượng khô [67].
Chỉ số sinh trưởng (GI) được tính bằng tỷ lệ giữa khối lượng tươi sau một thời gian nuôi cấy (g) và khối lượng tươi lúc đưa vào nuôi cấy (g).
* Khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon lên khả năng sinh trưởng của tế bào: trong thí nghiệm này sucrose được thay thế bằng đường glusose và fructose với các nồng độ 20-40 g/L, các điều kiện nuôi cây và các chỉ tiêu đánh giá được thiết lập dựa trên kết quả nghiên cứu tốt nhất thu được từ thí nghiệm trước đó. Đối chứng là công thức sử dụng 30 g/L sucrose.
* Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng lên sự phát triển của tế bào: môi trường cơ bản MS chứa nguồn carbon thích hợp từ thí nghiệm trước đã được sử dụng cho thí nghiệm này, các chất điều hòa sinh trưởng được sử dụng (cytokinin và auxin) gồm BAP (0,5-1,5 mg/L) hoặc KIN (0,5- 1,5 mg/L) kết hợp với 2,4-D (0,5-1 mg/L), các điều kiện nuôi cây và các chỉ tiêu đánh giá được thiết lập dựa trên kết quả nghiên cứu tốt nhất thu được từ thí nghiệm trước đó.