5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA LUẬN ÁN
1.4.3. Sản xuất oleanolic acid từ nuôi cấy tế bào đinh lăng lá nhỏ
Hiện nay, đã có một số công trình nghiên cứu tách chiết và sản xuất oleanolic acid từ nuôi cấy các loài đinh lăng lá nhỏ trong nước và trên thế
41
giới. Nguyễn Trung Hậu và cs (2015) đã nuôi cấy mô lá đinh lăng lá nhỏ tạo rễ tơ và nhận biết hoạt chất saponin tích lũy. Theo đó, mẫu lá được khử trùng bằng dung dịch Javel nồng độ 50%, trong 10 phút, cho tỷ lệ mẫu mô vô trùng đạt 96,3% sau 2 tuần nuôi cấy. Môi trường MS bổ sung NAA 1 mg/L thích hợp cho nuôi cấy mô lá tạo rễ tơ (0,322 g/cụm). Sự tăng sinh rễ tơ tốt nhất trên môi trường MS bổ sung NAA 0,5 mg/L là 2,018 g/cụm. Định lượng bằng HPLC cho thấy, rễ tơ in vitro tạo ra từ môi trường nuôi cấy tăng sinh có chứa hợp chất oleanolic acid 40,1 µg/g và saponin 396,2 µg/g [3].
Việc sản xuất oleanolic acid từ thực vật nói chung và từ cây đinh lăng lá nhỏ nói riêng cũng đã được nghiên cứu. Tuy nhiên, ứng dụng elicitor để cải thiện khả năng tích lũy oleanolic acid trong nuôi cấy tế bào huyền phù cây đinh lăng lá nhỏ chưa được công bố, do đó các nghiên cứu theo hướng này sẽ đảm bảo được tính mới của đề tài.
1.4.4. Xây dựng quy trình thu nhận hợp chất thứ cấp từ cây đinh lăng lá nhỏ
Bên cạnh các công trình nghiên cứu về sản xuất hợp chất thứ cấp từ nuôi cấy tế bào cây đinh lăng, các nghiên cứu để xây dựng quy trình thu nhận các hợp chất này cũng đã được nghiên cứu và công bố. Huỳnh Thị Mai Duyên và cs (2018) đã sử dụng phương pháp trích ly saponin triterpenoid bằng dung môi nhằm xác định ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu (<0,3-1 mm), loại dung môi (ethanol, nước, n-butanol), tỷ lệ nguyên liệu: dung môi (1:10 - 1:35), nhiệt độ trích ly (30-90oC) và thời gian trích ly (1-6 giờ) đến hàm lượng saponin triterpenoid và khả năng ức chế amylase của dịch trích lá đinh lăng lá nhỏ. Kết quả cho thấy, các thông số phù hợp cho quá trình trích ly là kích thước nguyên liệu bé hơn 0,3 mm, dung môi sử dụng ethanol với tỉ lệ nguyên liệu: dung môi 1:25, nhiệt độ 70oC và thời gian trích ly 4 giờ. Tại điều kiện này, hàm lượng saponin triterpenoid thu được là 1,60 mg/g và khả năng ức chế amylase 72,19% [2].
42
Ngoài dung môi, phá vỡ tế bào cũng là một yếu tố quan trọng trong quá trình ly trích saponin. Hà Thị Thanh Nga và cs (2019) đã nghiên cứu quá trình ly trích saponin triterpenoid tổng từ lá đinh lăng lá nhỏ với sự hỗ trợ của kỹ thuật siêu âm. Tác giả đã tiến hành khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu: nước, công suất siêu âm và thời gian siêu âm tới quá trình tríchly saponin triterpenoid tổng từ lá. Kết quả cho thấy cả 3 yếu tố đều có tác động đến hàm lượng saponintriterpenoid tổng thu được theo quy luật hàm bậc hai. Quá trình tối ưu hóa bằng phương pháp đáp ứng bề mặt đã thu được thông số tối ưu như thời gian siêu âm 20,75 phút, công suất siêu âm 221,32 W/g, với tỉ lệ nước: nguyên liệu là 29,50; lúc này hàm lượng saponin triterpenoid tổng thu được cao gấp xấp xỉ 2,5 lần so với mẫu không được xử lý siêu âm [16].
Sau khi ly trích, bảo quản cũng là một vấn đề cần được nghiên cứu, Nguyễn Hồng Anh và cs (2018) đã nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ bảo quản (5oC, 30oC, 60oC) đến hàm lượng saponin triterpenoid tổng, polyphenol tổng và hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết ethanol-lá đinh lăng lá nhỏ trong 30 ngày bảo quản. Nghiên cứu cho thấy 3 yếu tố này có mối tương quan thuận, chặt chẽ với nhau. Sau 30 ngày bảo quản, nhiệt độ 5oC có sự hao hụt về hàm lượng các chỉ tiêu thấp nhất trong tất cả các điều kiện bảo quản với sự tổn thất về hàm lượng saponin triterpenoid tổng, polyphenol tổng và khả năng kháng oxy hóa (bao gồm khả năng bắt gốc tự do DPPH và khả năng khử Fe3+) lần lượt là 9,55%, 19,81%, 4,18% và 34,6%. Kết quả nghiên cứu cho thấy, việc bảo quản ở điều kiện nhiệt độ thấp (khuyến cáo 5oC) giúp hạn chế tối đa sự hao tổn các hợp chất có hoạt tính sinh học [1].
43
Chương 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là cây đinh lăng lá nhỏ (Polyscias fruticosa (L.) Harms).
Hình 2.1. Cây đinh lăng lá nhỏ tự nhiên.
2.1.2. Nguyên liệu nghiên cứu
Nguyên liệu nghiên cứu là callus từ các bộ phận khác nhau của cây đinh lăng lá nhỏ in vitro do Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô của Bộ môn Công nghệ sinh học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế cung cấp.
Trong nghiên cứu này, có 3 loại callus được sử dụng để khảo sát nuôi cấy ban đầu, bao gồm callus có nguồn gốc từ lá, từ thân và từ rễ. Callus sử dụng trong nghiên cứu là callus 4 tuần tuổi và đã được cấy chuyển 3-4 lần.
44
Hình 2.2. Callus có nguồn gốc từ lá sau 5 tuần nuôi cấy (bar = 1 cm).
Hình 2.3. Callus có nguồn gốc từ thân sau 5 tuần nuôi cấy (bar = 1 cm).
Hình 2.4. Callus có nguồn gốc từ rễ sau 5 tuần nuôi cấy (bar = 1 cm). Các mẫu callus này được nuôi trong các bình tam giác có thể tích 250 mL (hoặc bình serum) chứa 50 mL môi trường rắn, đặt trong phòng nuôi cấy
45
có nhiệt độ 25±2oC, cường độ chiếu sáng 2.000 lux, thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày. Môi trường nuôi cấy là môi trường cơ bản MS có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng theo kết quả thăm dò sơ bộ trong các nghiên cứu trước đó.
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Các bước thực hiện thí nghiệm của luận án này được trình bày tóm tắt ở hình 2.5.
2.2.1. Hóa chất và môi trường nuôi cấy
Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đều đảm bảo tiêu chuẩn nghiên cứu, được trình bày cụ thể ở bảng 2.1.
Bảng 2.1. Các hóa chất chính sử dụng trong nghiên cứu
STT Tên hóa chất Hãng sản xuất Nước sản xuất
1 BAP Nacalai tesque Nhật Bản
2 2,4-D Nacalai tesque Nhật Bản
3 KIN Himedia Ấn Độ
4 Tryptone Himedia Ấn Độ
5 Casamino acids Sigma-Aldrich Đức
6 Sucrose Daejung Hàn Quốc
7 Glucose Merck Đức
8 Fructose Himedia Ấn Độ
9 YE Bio-rad Mỹ
10 MeJA Sigma-Aldrich Đức
11 Methanol for liquid chromatography
Merck Đức
12 Oleanolic acid Sigma-Aldrich Đức
Môi trường dinh dưỡng được sử dụng là MS cơ bản [80] có 30 g/L sucrose, 9 g/L agar, pH 5,8 được bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng khác nhau tùy theo mục đích của từng thí nghiệm. Môi trường được khử trùng ở 121oC trong 20 phút [67].
46
2.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên khả năng sinh trưởng của callus trưởng của callus
2.2.2.1. Ảnh hưởng của 2,4-D và KIN
Callus (0,3 × 0,3 cm) có nguồn gốc từ lá, thân và rễ của cây đinh lăng lá
nhỏ in vitro được nuôi trên môi trường cơ bản MS bổ sung 2,4-D có nồng độ
từ 0,5-3 mg/L và 0,5 mg/L KIN để thăm dò khả năng sinh trưởng của callus [17, 21]. Đối chứng là công thức nuôi cấy không bổ sung KIN và 2,4-D. Số liệu được thu sau 5 tuần nuôi cấy, từ đó rút ra nồng độ 2,4-D và KIN tối ưu cho các nghiên cứu tiếp theo.
Mẫu thí nghiệm được cấy trong các bình tam giác có thể tích 250 mL (hoặc bình serum) chứa 50 mL môi trường rắn, đặt trong phòng nuôi cấy có nhiệt độ 25±2oC, cường độ chiếu sáng 2.000 lux, thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày [67]. Số lượng callus/bình dao động từ 10-12 mẫu.
Sinh trưởng của callus được đánh giá dựa trên kích thước khối callus (đường kính), khối lượng tươi và khối lượng khô. Trạng thái vật lý của callus được xác định bằng đánh giá cảm quan. Callus sinh trưởng tốt nhất được dùng làm nguyên liệu cho các thí nghiệm nuôi cấy huyền phù.
Đường kính callus: được đo bằng thước kẹp.
Khối lượng tươi (FW): Khối callus được loại bỏ agar, cân để xác định khối lượng tươi.
Khối lượng khô (DW): Sau khi cân khối lượng tươi, callus được sấy khô ở 50oC đến khối lượng không đổi, cân để xác định khối lượng khô [67].
Chỉ số sinh trưởng (GI) được tính bằng tỷ lệ giữa khối lượng tươi sau một thời gian nuôi cấy (g) và khối lượng tươi lúc đưa vào nuôi cấy (g).
2.2.2.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ
47
nhất, có các đặc điểm hình thái thích hợp để nuôi cấy tế bào huyền phù sẽ được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.
Mẫu callus (0,3 × 0,3 cm) được cấy lên môi trường cơ bản MS chứa các chất điều hòa sinh trưởng ở điều kiện tối ưu, bổ sung dịch tryptone (0,2-1,6 g/L) hoặc casamino acids (0,2-1,6 g/L) để thăm dò khả năng sinh trưởng của callus [21]. Số lượng callus/bình dao động từ 10-12 mẫu. Đối chứng là công thức nuôi cấy không bổ sung tryptone hoặc casamino acids. Số liệu được thu sau 5 tuần nuôi cấy.
2.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên khả năng sinh trưởng của tế bào trưởng của tế bào
Callus có màu vàng, rời rạc, 30 ngày tuổi từ công thức nuôi cấy tốt nhất được sử dụng cho các nghiên cứu nuôi cấy huyền phù tế bào. Mẫu thí nghiệm được cấy trong các bình tam giác có thể tích 250 mL chứa 50 mL môi trường lỏng, đặt trong phòng nuôi cấy có nhiệt độ 25±2oC, cường độ chiếu sáng 500 lux, tốc độ lắc 120 vòng/phút và thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày [67]. Mỗi công thức thí nghiệm gồm 5 bình.
* Xây dựng đường cong sinh trưởng của tế bào: 2 g callus được cấy chuyển và nuôi trong bình tam giác chứa môi trường cơ bản MS lỏng (môi trường nuôi cấy tạo callus tốt nhất nhưng không có agar) với 30 g/L sucrose. Tế bào được thu liên tục 2 ngày/lần trong thời gian từ 2-22 ngày, khả năng sinh trưởng của tế bào được xác định qua khối lượng tươi, khối lượng khô và chỉ số sinh trưởng của tế bào [86].
Thu mẫu: dịch nuôi cấy tế bào huyền phù được lọc chân không, rửa sạch sinh khối bằng nước cất 2-3 lần sau đó được sử dụng làm nguyên liệu để đánh giá các chỉ tiêu liên quan.
48
bằng giấy lọc, rửa bằng nước cất và cân để xác định khối lượng tươi.
Khối lượng khô (DW): callus được sấy khô ở 50oC đến khối lượng không đổi, cân để xác định khối lượng khô [67].
Chỉ số sinh trưởng (GI) được tính bằng tỷ lệ giữa khối lượng tươi sau một thời gian nuôi cấy (g) và khối lượng tươi lúc đưa vào nuôi cấy (g).
* Khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon lên khả năng sinh trưởng của tế bào: trong thí nghiệm này sucrose được thay thế bằng đường glusose và fructose với các nồng độ 20-40 g/L, các điều kiện nuôi cây và các chỉ tiêu đánh giá được thiết lập dựa trên kết quả nghiên cứu tốt nhất thu được từ thí nghiệm trước đó. Đối chứng là công thức sử dụng 30 g/L sucrose.
* Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng lên sự phát triển của tế bào: môi trường cơ bản MS chứa nguồn carbon thích hợp từ thí nghiệm trước đã được sử dụng cho thí nghiệm này, các chất điều hòa sinh trưởng được sử dụng (cytokinin và auxin) gồm BAP (0,5-1,5 mg/L) hoặc KIN (0,5- 1,5 mg/L) kết hợp với 2,4-D (0,5-1 mg/L), các điều kiện nuôi cây và các chỉ tiêu đánh giá được thiết lập dựa trên kết quả nghiên cứu tốt nhất thu được từ thí nghiệm trước đó.
2.2.4. Xử lý elicitor
Môi trường tích lũy sinh khối và oleanolic acid tốt nhất từ các thí nghiệm trên được sử dụng để nghiên cứu khả năng sản xuất eloanolic acid từ tế bào có sử dụng các elicitor.
Thí nghiệm nuôi cấy được tiến hành tương tự như đối với các thí nghiệm nuôi cấy tế bào huyền phù. Ảnh hưởng của các loại elicitor là YE và MeJA được đánh giá bằng cách bổ sung vào môi trường với các nồng độ elicitor khác nhau tại các thời điểm khác nhau (thời điểm ban đầu và sau 3, 6, 9 ngày nuôi cấy). Trong đó, MeJA có nồng độ từ 10-100 µM, YE từ 1-3 g/L.
49
Mẫu thí nghiệm được cấy trong các bình tam giác có thể tích 250 mL chứa 50 mL môi trường lỏng, đặt trong phòng nuôi cấy có nhiệt độ 25±2oC, cường độ chiếu sáng 500 lux, tốc độ lắc 120 vòng/phút và thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày [67]. Mỗi công thức thí nghiệm gồm 5 bình.
Sinh khối tế bào được thu hoạch sau 16 ngày nuôi để xác định khối lượng tươi, khối lượng khô và hàm lượng oleanolic acid. Trong thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nồng độ elicitor, đối chứng là công thức không bổ sung elicitor. Trong thí nghiệm xác định ảnh hưởng của thời gian xử lý elicitor, đối chứng là công thức xử lý elicitor ở nồng độ tốt nhất vào thời điểm bắt đầu nuôi cấy (ngày 0).
2.2.5. Định lượng oleanolic acid
2.2.5.1. Tách chiết oleanolic acid
Mẫu (mẫu tự nhiên, tế bào huyền phù) sau khi xác định khối lượng tươi được sấy khô ở 50oC đến khối lượng không đổi, sau đó cân để xác định khối lượng khô [86]. Mẫu khô sau đó được nghiền mịn và chiết với methanol (Merck, Đức) theo tỷ lệ 1 g bột mẫu: 5 mL methanol. Hỗn hợp chiết được trộn đều và ủ ở 37oC trong 10 phút. Hỗn hợp được phân làm hai lớp sau khi ủ, hút cẩn thận lấy dịch nổi phía trên, lặp lại 3 lần để thu dịch chiết tế bào. Mẫu chiết được đem sấy ở 50oCqua đêm đến khi methanol bay hơi hết. Tiếp theo bổ sung methanol với thể tích tương đương ban đầu để tái hòa tan oleanolic acid. Dịch chiết oleanolic acid của tế bào thân đinh lăng lá nhỏ được lọc qua màng lọc 0,45 µm, bảo quản ở 4oC để sử dụng cho phân tích HPLC sau này.
2.2.5.2. Phân tích HPLC
Hàm lượng oleanolic acid được xác định bằng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) theo Kochkin và cs (2014) [56].
50
và 0,1% acetic acid, với cột C18 (InertSustain C18 5 µm, 4,6×250 mm), nhiệt độ cột 24oC, tốc độ dòng 1 mL/phút, thể tích tiếp mẫu 5 µL. Oleanolic acid được phát hiện ở bước sóng 210 nm. Phân tích HPLC được tiến hành trên hệ thống sắc kí HPLC Shimadzu LC20A (Shimadzu, Nhật Bản).
Tất cả dung môi đạt tiêu chuẩn phân tích HPLC được mua từ hãng Merck (Đức). Oleanolic acid của hãng Sigma được dùng làm chất chuẩn để xác định hàm lượng oleanolic acid (Bảng 2.1). Hàm lượng oleanolic acid được xác định dựa theo đường chuẩn xây dựng từ diện tích đỉnh (peak) của các nồng độ oleanolic acid chuẩn khác nhau trong phân tích HPLC.
Phương trình đường chuẩn là: y = 3456x + 588,42 (R2 = 0,9966), trong đó: y là hàm lượng oleanolic acid (µg/mL), x là diện tích đỉnh.
Hàm lượng oleanolic acid trong sinh khối khô được tính theo công thức: C (mg/g) = y.V/(m.1000), trong đó: V là thể tích mẫu chiết (mL), m là khối lượng mẫu để chiết (g), 1000 là đơn vị quy đổi từ mg sang µg.
2.2.6. Xử lý thống kê
Các thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên. Thí nghiệm nuôi cấy callus được lặp lại 3 lần, mỗi lần 3 bình, mỗi bình chứa 10-12 mẫu callus. Thí nghiệm nuôi cấy tế bào được lặp lại 3 lần, mỗi lần 5 bình. Các thí nghiệm phân tích HPLC được lặp lại 3 lần. Số liệu được xử lý bằng phương pháp thống kê sinh học, phân tích one-way ANOVA bằng Duncan’s test theo chương trình SPSS 22.0 với mức xác suất có ý nghĩa p<0,05.
51
Hình 2.5. Sơ đồ thí nghiệm
Callus (từ thân, rễ, lá)
Xác định sinh trưởng của tế bào Đường cong
sinh trưởng
Lựa chọn loại callus và thiết lập nuôi cấy tế bào huyền phù
Đánh giá khả năng sinh trưởng của callus
Ảnh hưởng của nguồn carbon Ảnh hưởng của chất ĐHST Sự tích lũy oleanolic acid Xử lý elicitor
(dịch chiết nấm men và methyl jasmonate)
Xác định sự tích lũy oleanolic acid
52
Chương 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY ĐẾN SINH TRƯỞNG CỦA CALLUS TRƯỞNG CỦA CALLUS
3.1.1. Ảnh hưởng của 2,4-D kết hợp với KIN lên sinh trưởng của callus
Callus có nguồn gốc từ lá, thân và rễ của cây đinh lăng lá nhỏ in vitro
được cấy lên môi trường dinh dưỡng chứa 2,4-D và KIN để đánh giá khả năng sinh trưởng của callus. Sự sinh trưởng của callus sau 5 tuần nuôi cấy được trình bày ở bảng 3.1-3.3.
3.1.1.1. Callus có nguồn gốc từ lá