Các phương pháp dùng trong chẩn đốn bệnh dại

Một phần của tài liệu Nghiên cứu tình hình bệnh dại trên một vài loài động vật ở Đồng bằng sông Cửu Long và xây dựng qui trình phòng chống bệnh (Trang 44)

2.4.1 Chẩn đốn lâm sàng

Chẩn đốn dựa vào lâm sàng rất khĩ khăn, nhất là ở những nơi bệnh dại khơng phổ biến. Trong giai đoạn đầu, bệnh dại dễ bị nhầm lẫn với một số bệnh khác, nên sử dụng các kỹ thuật chẩn đốn phịng thí nghiệm khi nghi ngờ bệnh dại. Động vật nghi ngờ dại phải được giết chết sau khi gây mê và cắt đầu gửi tới các phịng thí nghiệm chẩn đốn. Chẩn đốn dại được thực hiện ở những phịng thí nghiệm chất lượng cao, được chỉ định bởi các cơ quan y tế hoặc thú y cĩ thẩm quyền, phù hợp với những nghị định chuẩn hĩa cĩ hiệu lực cho xét nghiệm bệnh dại. Khi chẩn đốn lâm sàng bệnh dại cần căn cứ vào các đặc điểm như: tiền sử bị chĩ cắn sau đĩ chĩ chết vì dại. Biểu hiện sợ nước, sợ giĩ điển hình.

Cần chẩn đốn phân biệt bệnh dại với các bệnh khác. Biểu hiện sợ nước, sợ giĩ cĩ thể gặp trong nhiều bệnh ngồi dại như sốt phát ban do Rickettsia, sốt rét ác tính, sảng nhiễm trùng. Đơi khi cịn gặp biểu hiện này ở phụ nữ khi thai nghén hoặc viêm màng tim. Ngồi ra cịn gặp ở bệnh nhân uốn ván nhưng ở bệnh nhân uốn ván cịn cĩ biểu hiện cứng hàm và co cứng cơ liên tục. Nhiều trường hợp dại bị chẩn đốn nhầm với các rối loạn tâm thần. Sảng rượu cũng cĩ các biểu hiện loạn thần nhưng khơng cĩ co thắt hầu họng và rối loạn hơ hấp. Tình trạng bệnh liên tục chứ khơng cĩ từng cơn như bệnh dại. Những trường hợp bị chĩ cắn nhưng chĩ khơng phải bị dại mà vẫn sống. Bệnh nhân quá lo sợ nên cĩ các biểu hiện bệnh tưởng như lên cơn sợ giĩ, sợ nước tuy khơng co thắt cơ hầu họng và thậm chí cịn sủa như chĩ sủa. Dại thể bại liệt cần phân biệt với hội chứng Guillain-Barré và các căn nguyên gây liệt khác, trong đĩ cĩ viêm tủy và ép tủy. Cũng khơng loại trừ được khả năng tai biến liệt do vaccine (Nguyễn Tường Vân và Nguyễn Quốc Thái, 2013).

2.4.2 Chẩn đốn phịng thí nghiệm2.4.2.1 Phương pháp giải phẫu vi thể 2.4.2.1 Phương pháp giải phẫu vi thể

Xác định tiểu thể Negri cĩ trong tổ chức não (trong não của chĩ mắc bệnh dại cĩ thể Negri). Thể Negri cĩ hình dạng thay đổi, đĩ là những hạt nhỏ hình trịn, hình trứng, hình bầu dục, kích thước biến động từ 0,5 – 30 µ, chúng thường được tìm thấy trong neuron thần kinh, chủ yếu ở sừng Amon, cịn ở trong tế bào tiểu não thì cĩ ít hơn. Thể Negri là dấu hiệu đặc thù của bệnh dại, khi phát hiện ra thể Negri trong tế bào não của động vật mắc bệnh, cĩ thể chẩn đốn và xác định là con vật mắc bệnh dại. Mơ não kiểm tra phải bao gồm cuống não và tiểu não, chúng phải được bảo quản trong thùng lạnh.

2.4.2.2 Phương pháp phát hiện kháng nguyên virus

Xác định bệnh dại qua việc phát hiện kháng nguyên virus dại trong mẫu bệnh phẩm cho kết quả nhanh và chính xác đang được áp dụng như kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang, tiêm truyền động vật thí nghiệm. Ở Việt Nam, chỉ một vài trung tâm được trang bị các

phương tiện kỹ thuật hiện đại để chẩn đốn phát hiện chính xác bệnh dại, trong đĩ cĩ VVSDTTƯ và Trung Tâm Chân đốn Thú y trung ương ở Thủ đơ Hà Nội, Viện Pasteur, Viện Vệ sinh và Y tế Cơng cộng, Chi cục Thú y thành phố Hồ Chí Minh.

2.5 Hệ gene của virus dại2.5.1 Nucleoprotein (N) 2.5.1 Nucleoprotein (N)

Nucleoprotein (N) của RABV chứa 450 acid amine, một trong số đĩ ở vị trí 389 (S389) được phosphoryl hĩa và cĩ trọng lượng phân tử là 57 kDa. N trong RABV dường như được phosphoryl hĩa bởi một casein kinase II của tế bào (Marston et al., 2007). Trình tự acid amine của N được bảo tồn nhiều nhất trong số các protein của virus và giữ các chức năng chính của virus. Mặc dù bản chất N được bảo tồn nhưng vẫn cĩ sự đa dạng di truyền tương đối cao trong các đoạn ngắn của gen N. Mặt khác, đột biến acid amine trên gen N sẽ tạo nên các loại kháng nguyên khác nhau giữa các chủng virus với kháng thể đơn dịng kháng N (MAbs) (Kuzmin et al., 2005).

Vị trí tương tác trực tiếp của N với vRNA tại các acid amine 149, 161, 168, 225, 235, 237, 290, 298, 323, 352 và 434. Sau khi liên kết với vRNA, N sẽ thay đổi cấu trúc tại vị trí Ser389. Sự phosphoryl hĩa N tại Ser389 giúp tăng sự tương tác giữa N và P trong RNP của virus dại (Toriumi and Kawai, 2004). Sự phosphoryl hĩa N trong vRNA hoặc cRNA là rất quan trọng để điều chỉnh quá trình phiên mã và sao chép vRNA (Liu et al., 2004).

Gen N được quan tâm nhiều nhất vì nĩ tạo ra miễn dịch chống lại virus dại gây chết người ở động vật (Liu et al., 2004). Vị trí liên kết với kháng thể ở các dạng khác nhau của N là biểu hiện của sự phân bố trong tế bào chất với RNP virus. Thực tế là N liên kết với tế bào chất của IB hoặc NB. N trưởng thành là một Mab đặc hiệu cho vị trí kháng nguyên II và nĩ chỉ nhận ra một vị trí liên kết kháng thể cụ thể trên kháng nguyên N liên kết với IB. Vị trí liên kết với kháng thể phụ thuộc cấu trúc kháng nguyên II và III tại Ser389 của N-RNA (Lahaye et al., 2012).

N cũng là mục tiêu chính của các tế bào T hỗ trợ (Th) thực hiện các phản ứng chéo giữa bệnh dại và các virus liên quan đến bệnh dại. Ngồi ra, N RABV cịn cĩ chức năng ngoại sinh. Nĩ được xem là siêu kháng nguyên của virus được xác định ở người. Một số thuộc tính và phản ứng thích hợp khơng chỉ được tìm thấy ở người mà cịn xảy ra ở chuột được cho là do N RABV cĩ vai trị siêu kháng nguyên bao gồm (1) khả năng kích hoạt các tế bào lympho máu ngoại vi trong vaccine ở người, (2) tạo ra phản ứng VNA nhanh hơn và cao hơn khi tiêm vaccine phịng dại bất hoạt, (3) kích hoạt và huy động các tế bào T CD4 + Vb8 để kích thích và hỗ trợ sản xuất VNA, (4) khả năng liên kết với các kháng nguyên HLA II biểu hiện trên bề mặt tế bào (Jiang et al., 2010, Lahaye et al., 2009).

2.5.2 Phosphoprotein (P)

Phosphoprotein (P) chứa 297 acid amine (38 kDa) và ít được bảo tồn nhất trong năm loại protein RABV. Sự đa dạng trong trình tự của P cũng lớn nhất (43 - 97%), hai vùng cĩ sự đột biến lớn nhất là 52 - 78 và 155 - 178 (Marston et al., 2007). P là một

loại protein đa chức năng và đa diện. Nĩ kết hợp với N để tạo thành phức hợp N - P và hoạt động như một chaperone để tổng hợp N mới, ngăn cản quá trình tự lắp ráp và liên kết khơng đặc hiệu với RNA tế bào, đĩng vai trị định hướng trong quá trình gấp khúc N của vRNA. P cịn là một tiểu đơn vị của phức hợp RNA polymerase (P - L), P đĩng một vai trị quan trọng như một đồng yếu tố khơng xúc tác trong quá trình phiên mã và sao chép bộ gen virus. P ổn định L và tạo phức hợp P - L trên khuơn mẫu RNA, nếu thiếu P thì protein L khơng thể thực hiện được (Mavrakis et al., 2003).

Giống như các virus sợi âm khác, P tồn tại ở nhiều dạng phosphoryl hĩa khác nhau. Hai dạng P nổi bật hiện diện trong cả virion bệnh dại và trong các tế bào bị nhiễm virus là 37kDa và 40 kDa (Toriumi and Kawai, 2004). P RABV được phosphoryl hĩa ở đầu N bởi hai loại protein kinase riêng biệt là 71-kDa và protein kinase C. Phosphoryl hĩa P tái tổ hợp 36 kDa (biểu hiện ở E. coli) ở S63 và S64 và 37 kDa (biểu hiện trong thận chuột). Trong cả hai trường hợp, quá trình phosphoryl hĩa làm thay đổi tính linh động của P (36 kDa và 37 kDa) trong điện di trên gel sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide (SDS-PAGE) làm nĩ di chuyển chậm hơn.

P RABV liên kết với N và L thơng qua các miền đặc trưng của P cho từng loại. Ít nhất hai vị trí liên kết N độc lập đã được tìm thấy trên P (Castel et al., 2009). Một vị trí ở đầu C của N trong phức hợp RNA-N (giữa các acid amine 267 và 297) và một vị trí ở đầu N giữa các acid amine 69 và 177. Cả hai vị trí sẽ tương tác với N theo một cách độc lập lẫn nhau. Sự tương tác liên quan đến vị trí liên kết đầu N (40 acid amine đầu tiên) của P cĩ thể cạnh tranh với RNA nội sinh và tạo thành các dimer kéo dài (Gerard

et al., 2007).

Trong quá trình hình thành RNP mới, P sẽ liên kết với L để tạo ra phức hợp mã hĩa RNA polymerase virus hoạt động. P cĩ vị trí liên kết với L trong 19 acid amine đầu tiên của P. Quá trình oligome của P RABV diễn ra ở 52 acid amine đầu tiên của N (Albertini et al., 2011). Một tính năng đặc biệt của protein P RABV là khả năng tương tác với nhiều protein của tế bào chủ. LC8 tương tác mạnh với P của RABV và MOKV do tham gia vào quá trình vận chuyển nội bào của các bào quan. P tương tác với LC8 trong vùng acid amine 138 và 172. Sự liên kết của P với LC8 khơng theo quá trình vận chuyển trục của RABV vì việc xĩa vùng liên kết LC8 khơng thay đổi sự xâm nhập của RABV vào thần kinh trung ương. Tuy nhiên, việc xĩa vùng liên kết LC8 đã ức chế đáng kể sự sao chép của virus dẫn đến mất khả năng lây nhiễm của virus trong thần kinh trung ương (Kammouni et al., 2015; 2017).

Ngồi ra, vai trị quan trọng của P RABV là chống lại miễn dịch bẩm sinh của vật chủ, đặc biệt là hệ thống interferon loại I / III. Các IFN này được tạo ra trong các tế bào bị nhiễm viurs sau khi cảm nhận được sự xâm nhập của mầm bệnh (PAMP hoặc DAMP) hoặc acid nucleic của virus. Sau đĩ, các IFN được tiết ra, thơng qua tín hiệu JAK/STAT kích thích quá trình phiên mã của hàng trăm gen để tạo kháng thể hoặc miễn dịch dẫn đến trạng thái kháng virus mạnh mẽ. RABV P khơng kích hoạt các tín hiệu hoạt hĩa quá trình phiên mã của các gen interferon cũng như các con đường truyền tín hiệu interferon, do đĩ hạn chế việc thiết lập phản ứng của vật chủ kháng virus ( Honda and Taniguchi, 2006).

2.5.3 Large protein (L)

L RABV cĩ khoảng 2142 acid amine và chiếm 54% khả năng mã hĩa của bộ gen. L là thành phần xúc tác tạo phức hợp polymerase, cùng với P chịu trách nhiệm về các hoạt động của enzym liên quan đến quá trình sao chép và phiên mã của RNA virus, bao gồm cả RNA phụ thuộc. RNA polymerase (RdRP) được hình thành do sự kết hợp của PRNTase và MTase. So sánh trình tự L từ các virus RNA sợi âm khác nhau giúp xác định sự tương đồng về mặt chức năng trong nỗ lực xác định vị trí các hoạt động của enzyme. Giống như các virus RNA sợi âm, RNA polymerase của RABV gắn với virion đĩng vai trị cho sự khởi đầu quá trình lây nhiễm. Quá trình này bắt đầu bằng sự phiên mã sơ cấp của RNA bộ gen sau khi lõi RNP được phĩng thích vào tế bào chất của tế bào chủ (Morin et al., 2017; Ogino et al., 2016).

Một trong những điểm nổi bật của L khi tiến hành so sánh trình tự là số lượng acid amine được bảo tồn dọc theo protein trong các khối từ I đếnVI. Một số vùng được bảo tồn với tỷ lệ cao các acid amine được duy trì ở các vị trí giống hệt nhau, trong khi các miền khác thay đổi nhiều hơn để phù hợp với bản chất đa chức năng của L. Trong số các trình tự được bảo tồn cần lưu ý GDN (glycine, acid aspartic và asparagin) vì được bảo tồn rộng rãi ở tất cả các virus RNA sợi âm khơng phân đoạn. Ít nhất hai trình tự khác giữa các acid amine 754 đến 778 và 1332 đến 1351 trong L đã được xác định là các vị trí để liên kết và sử dụng ATP. Ba hoạt động thiết yếu được mã hĩa bởi L tham gia vào quá trình liên kết và sử dụng ATP là (1) hoạt động phiên mã liên kết với các rNTPs, (2) polyadenyl hĩa, và (3) hoạt động protein kinase để phosphoryl hĩa P trong quá trình phiên mã (Ogino et al., 2010).

2.5.4 Matrix protein (M)

M RABV là loại nhỏ nhất trong số các virion protein với 202 acid amine (25 kDa), hình thành dimer liên kết mạnh mẽ với G. M liên kết và tạo thành phức hợp protein RNP-M và cuộn chặt lại tạo ra cấu trúc “khung xương” hình viên đạn của virion. Đồng thời, M làm trung gian liên kết cấu trúc lõi virus với màng tế bào vật chủ, nơi nĩ bắt đầu sự xâm nhập của virus (Nakahara et al., 2003).

PPEY (proline-rich motif) trong M được cho là cĩ liên quan đến sự xâm nhập nhanh của virus từ bề mặt màng tế bào. Cịn các PPxY, PT / SAP, YxxL và FPIV được tìm thấy trong M được xem là vùng xâm nhập muộn (miền L). Kết quả là làm tăng số lượng virion do sự tương tác giữa gai xuyên màng G và lõi RNP-M của virus trong quá trình lắp ráp RABV cho thấy hoạt động phối hợp của cả protein lõi và gai hỗ trợ sự phục hồi hiệu quả của virion (Lij et al., 2008).

2.5.5 Glycoprotein (G)

G RABV cĩ 505 acid amine, là một glycoprotein xuyên màng type I, đầu N dài 22 acid amine nằm ở vùng ngoại bào, đầu C dài 44 acid amine nằm trong tế bào chất. Kết quả G xuyên màng trong bộ máy Golgi tạo thành các gai G gắn trong màng sinh chất và trên bề mặt virion. Các gai G dài 8,3 nm và đại diện cho protein bề mặt chính của virion. Đầu N nằm ở vùng ngoại bào chịu trách nhiệm tương tác với các vị trí liên kết với thụ thể và rất quan trọng trong quá trình sinh bệnh của virus. Nĩ cũng là nguyên nhân trong phản ứng pH thấp của vỏ virus với huyết tương và màng nội bào trong giai đoạn đầu của vịng đời RABV. Và nĩ rất quan trọng đối với việc gây ra phản ứng miễn dịch dịch thể của vật chủ đối với sự lây nhiễm RABV và trung hịa kháng thể virus (VNA) (Albertini et al., 2012; Tao et al., 2010).

RABV G cịn cĩ vai trị quan trọng là xác định khả năng gây bệnh và con đường xâm lấn thần kinh của virus. Tuy đặc tính hướng thần kinh của một chủng RABV là do G quyết định nhưng cũng cần lưu ý các thành phần và đặc tính khác của virus vì nĩ cũng quyết định việc thay đổi cơ chế bệnh sinh của virus. Việc xâm nhập của virus cĩ gây tử vong hay khơng, được xác định bởi sự tương tác của các vị trí đột biến trên G với một thụ thể trên tế bào thần kinh in vivo. Vị trí liên kết thụ thể p75NTR trên RABV G (vị trí 318 - 352) cho thấy ở cả hai vị trí kháng nguyên III và “a” khơng bị trung hịa bởi kháng thể kháng G (Tao et al., 2010). Các vectơ ngoại vi giả định với RABV G cho thấy G khơng chỉ cho phép xâm nhập vào hệ thần kinh, mà cịn tạo điều kiện và tăng cường vận chuyển ngược trục đến thần kinh trung ương của virus. Trong nhiều chủng RABV khả năng gây bệnh hoặc độc lực của virus tương quan với một acid amine duy nhất tại một vị trí cụ thể trong RABV G. Ví dụ, tại vị trí 333 arginine (R) đột biến thành lysine

(K) tạo kiểu hình cĩ độc lực hoặc kiểu xâm nhập thần kinh của RABV trong thần kinh trung ương. Các biến thể tại vị trí 333 arginine (R) của virus dại bị đột biến thành glutamine (Q), isoleucine (I), glycine (G), methionine (M), hoặc serine (S) tạo nên G cĩ kiểu hình ít gây bệnh hơn hoặc khơng gây bệnh so với virus nguyên thủy. Mặc dù những đột biến đặc biệt này trong G tương quan với việc giảm hoặc loại bỏ sự xâm nhập vào hệ thần kinh, đồng thời khơng làm suy giảm khả năng nhân lên của virus trong quá trình nuơi cấy tế bào. Tuy nhiên, một vài sự đột biến khác tại vị trí 333 như Q thành R hoặc R333Q cĩ thể làm ảnh hưởng đến tốc độ lây lan của virus từ tế bào này sang tế bào khác và khả năng lây nhiễm tế bào thần kinh vận động in vivoin vitro (Sato et al., 2009). Sự thay thế R333Q cũng liên quan đến khả năng khác của virus là gây ra quá trình chết

tế bào thần kinh theo chương trình. Tuy nhiên, các đột biến acid amine khác ở các vị trí khác trên RABV G đã làm ảnh hưởng đến khả năng gây bệnh của virus. Ví dụ, các đột

Một phần của tài liệu Nghiên cứu tình hình bệnh dại trên một vài loài động vật ở Đồng bằng sông Cửu Long và xây dựng qui trình phòng chống bệnh (Trang 44)