Để khảo sát nhận thức chủ vật nuơi về bệnh dại, tiến hành lập phiếu khảo sát (phụ lục 2) và thực hiện khảo sát các hộ nuơi trên thực địa để thu thập và thống kê các thơng tin như:
- Hiểu biết bệnh dại là truyền chủ yếu từ chĩ; - Bệnh dại cĩ gây chết người;
- Cần phải tiêm phịng dại cho chĩ, - Tiêm phịng dại đúng lịch cho chĩ; - Gia đình cĩ người bị chĩ cắn;
- Số trẻ em nhỏ hơn 15 tuổi bị chĩ cắn; - Tiêm phịng dại sau khi bị chĩ cắn, …
3.4.3 Khảo sát sự hiện diện của kháng thể kháng virus dại trên đàn chĩ, mèo thả rơng và tại điểm giết mổ
Khảo sát tỷ lệ bảo hộ của chĩ, mèo thả rơng và tại điểm giết mổ đối với virus bệnh dại bằng phương pháp điều tra cắt ngang thơng qua việc lấy máu của chĩ, mèo thả rơng và tại nơi thu gom chĩ (mèo) để kiểm tra hiệu giá kháng thể chống virus dại tại các địa phương TP. Cần Thơ, Bến Tre.
Bến Tre là một trong 13 tỉnh/thành vùng ĐBSCL với đặc thù là một tỉnh cù lao, hệ thống sơng ngịi chằng chịt, tỉnh cĩ tổng đàn chĩ lớn nhất vùng ĐBSCL nhưng tỷ lệ tiêm phịng dại cho chĩ lại thấp hơn 10%. Chính vì vậy, nghiên cứu tập trung lấy mẫu huyết thanh trên chĩ chưa tiêm phịng thả rơng ở 01 thành phố (TP. Bến Tre), 05 huyện (Giồng Trơm, Châu Thành, Ba Tri, Mỏ Cày Nam, Chợ Lách) thuộc tỉnh Bến Tre, mẫu được lấy ngẫu nhiên phi xác suất và được bố trí thu mẫu cụ thể được trình bày ở Bảng 3.1.
Bảng 3.1: Bố trí lấy mẫu máu chĩ nuơi (thả rơng) tại Bến Tre
Khu vực Thành phố, huyện Số mẫu khảo sát
TP. Bến Tre 45
Nội ơ Huyện Châu Thành 46
Huyện Giồng Trơm 45
Huyện Mỏ Cày Bắc 46
Ngoại ơ Huyện Ba Tri 52
Huyện Chợ Lách 52
Tổng cộng 286
Cần Thơ là thành phố lớn, hiện đại và phát triển bậc nhất ở Đồng Bằng Sơng Cửu Long, thành phố lớn thứ 4 cả nước, đồng thời là một đơ thị loại 1, thành phố trực thuộc Trung ương. Cần Thơ cịn là trung tâm cơng nghiệp, thương mại - dịch vụ, giáo dục - đào tạo và khoa học - cơng nghệ, y tế và văn hĩa của vùng ĐBSCL, là địa phương cĩ tổng đàn chĩ thấp nhất vùng ĐBSCL nhưng tỷ lệ tiêm phịng dại đạt trên 80% trong những năm gần đây. Chính vì vậy, mẫu máu của chĩ được lấy tại nơi thu gom tại 6 quận/huyện thuộc TP. Cần Thơ; Đối với mẫu máu mèo (59 mẫu) chỉ được lấy ngẫu nhiên ở một số nơi thu gom mèo (quán tiểu Hổ) tại TP. Cần Thơ. Mẫu khảo sát ở TP. Cần Thơ được thu thập và bố trí theo Bảng 3.2.
Bảng 3.2: Bố trí lấy mẫu máu chĩ, mèo tại nơi thu gom ở TP. Cần Thơ
Số mẫu xét nghiệm
Khu vực Quận, huyện
Chĩ Mèo
Nội thành Ninh Kiều 55 20
Bình Thủy 33 20
Cái Răng 20 19
Ngoại thành Phong Điền 22
Ơ Mơn 22
Vĩnh Thạnh 32
a. Phương pháp lấy mẫu
Mẫu máu chĩ được lấy sau khi chĩ được khớp mõm, cố định các chân. Đầu tiên cần cắt lơng, sát trùng tại vị trí lấy mẫu (tĩnh mạch chân trước hoặc tĩnh mạch chân sau) cho chĩ, mèo sau đĩ thắt dây garo (hoặc cĩ thể dùng tay) chặn phần trên của tĩnh mạch cần lấy để lộ rõ mạch máu; dùng tay thuận (tay phải) đưa kim 23G của ống tiêm nhựa nhẹ nhàng vào mạch để lấy máu (khoảng 2 - 3 ml máu/con). Sát trùng và cầm máu sau khi lấy máu.
Mẫu máu sau khi lấy được cho vào ống trữ đơng máu, ký hiệu mẫu, rồi trữ lạnh bằng thùng đá, và để đơng tự nhiên, sau đĩ ly tâm 3.500 vịng/phút trong 5 phút để tách huyết thanh. Huyết thanh thu được cho vào ống eppendorf 1,5ml đã được ký hiệu mẫu.
Mẫu huyết thanh tiếp tục được bảo quản lạnh rồi vận chuyển về phịng thí nghiệm, mẫu huyết thanh trữ lạnh ở 2 - 8oC đảm bảo sử dụng trong vịng 5 ngày và ở -20oC nếu sử dụng quá 5 ngày. Đối với mẫu cấp đơng ở -20oC khi xét nghiệm phải rã đơng, chuyển xuống ngăn mát của tủ và trộn đều mẫu trước khi tiến hành xét nghiệm.
b. Phương pháp ELISA
Mẫu máu sau khi lấy được phân tích đánh giá bằng phương pháp dịch tễ học phân tích. Mẫu được xét nghiệm bằng kỹ thuật ELISA gián tiếp để xác định hàm lượng kháng thể dại trên chĩ, mèo và một số động vật hoang, bộ kit được sử dụng là SERELISA®Rabies Ab Mono Indirect (Pháp) và được đọc trên máy đo bước sĩng (BIO-TEX, model Epoch của Mỹ) để phát hiện kháng thể dại.
Hình 3.7: Bộ kit phản ứng ELISA và máy đọc ELISA
Nguyên lý phản ứng
Kit SERELISA®Rabies Ab Mono Indirect cho phép định lượng kháng thể bệnh dại trong mẫu huyết thanh của từng cá thể động vật. Hàm lượng kháng thể tối thiểu 0,6 IU/ml là cĩ thể bảo hộ chống bệnh dại (WHO, 1992). Phản ứng bao gồm 3 bước:
- Cho mẫu huyết thanh vào giếng đã gắn kháng nguyên virus dại vơ hoạt. Kháng thể hiện diện trong mẫu kết hợp với kháng nguyên virus phủ ở đáy giếng.
- Sau khi rửa, thêm protein A - conjugate vào để kết hợp với kháng thể bắt giữ trước đĩ, hình thành phức hợp (Rabies Ag) - (Ab anti-Rabies) - (Protein A/peroxidase).
-Tiếp tục rửa để loại bỏ conjugate thừa, Enzyme gắn với phức hợp được phát hiện bằng cách thêm chất nền, làm sản phẩm cĩ màu. Sau khi ngừng phản ứng, đo mật độ quang học. Sự hiện diện hay vắng mặt của kháng thể được xác định bằng giá trị của ngưỡng thu được từ đối chứng dương.
c. Quy trình thực hiện phản ứng
Cơng tác chuẩn bị: thực hiện cẩn thận việc phân bổ mẫu nhằm dễ dàng nhận diện
và phân biệt mẫu đối chứng và mẫu xét nghiệm. Các nội dung cần thực hiện:
(1) Chuẩn bị mẫu huyết thanh: Pha lỗng mẫu với chất pha lỗng mẫu (SD) như sau: mẫu được pha lỗng lần 1 ở 1/10 trong đĩa trống (10µl mẫu pha với 90µl SD).
(2) Chuẩn độ huyết thanh, 07 độ pha lỗng huyết thanh chuẩn (WHO,1992) được tiến hành ngay trên ống hay đĩa với độ pha lỗng 1/10; 1/30; 1/100; 1/150; 1/300; 1/1.000 và 1/3.000 theo như Bảng 3.3.
Bảng 3.3: Dãy pha lỗng huyết thanh chuẩn trong phản ứng ELISA (WHO, 1992)
Tỷ lệ pha lỗng Cách pha lỗng
1/10 10µl huyết thanh chuẩn + 90µl SD
1/30 10µl huyết thanh chuẩn + 290µl SD
1/100 10µl của 1/10 + 90µl SD 1/150 20µl của 1/30 + 80µl SD 1/300 10µl của 1/30 + 90µl SD 1/1.000 10µl của 1/100 + 90µl SD 1/3.000 10µl của 1/300 + 90µl SD Chú thích: SD là chất pha lỗng mẫu
Thực hiện phản ứng gồm các các bước như sau:
(1) Phân bổ đối chứng và mẫu xét nghiệm
- Phân bổ đối chứng: đối chứng khơng cĩ sẵn và nên được pha lỗng 1/10; sau đĩ lấy 90µl chất pha lỗng mẫu +10 µl đối chứng âm của kit cho vào giếng A1 & A2; 10 µl đối chứng dương của kit cho vào giếng B1 & B2.
- Phân bổ mẫu và pha lỗng huyết thanh theo chuẩn của WHO (Bảng 3.4): lấy 90µl chất pha lỗng mẫu cùng với 10µl mẫu tiền pha lỗng 1/10 hay huyết thanh chuẩn, pha lỗng từ 1/10 đến 1/3.000 trong giếng test và trộn đều. Chú ý luơn đặt strip theo thứ tự sao cho sử dụng được cả hai máy rửa và máy đọc. Sau đĩ, phủ lên giếng tấm film với chiều dài tấm film vừa vặn với giếng đã dùng và trộn đều bằng cách lắc nhẹ bằng máy lắc. Bảng 3.4: Định lượng kháng thể (pha lỗng cuối cùng) trong phản ứng ELISA
1 2 3 4 A N 1/10 N 1/10 WHO 1/30.000 WHO 1/30.000 B P 1/10 P 1/10 S1 1/100 S1 1/100 C WHO 1/100 WHO 1/100 S2 1/100 S2 1/100 D WHO 1/300 WHO 1/300 S3 1/100 S3 1/100 E WHO 1/1.000 WHO 1/1.000 S4 1/100 S4 1/100 F WHO 1/1.500 WHO 1/1.500 S5 1/100 S5 1/100 G WHO 1/3.000 WHO 1/3.000 S6 1/100 S6 1/100 H WHO 1/10.000 WHO 1/10.000 S7 1/100 S7 1/100
Chú thích: N: đối chứng âm; P: đối chứng dương
Giá trị OD cĩ thể thấy ở pha lỗng WHO 1/100. Trường hợp này, dùng tiếp 06 mức pha lỗng tiếp theo để vẽ đường cong hồi qui.
(2) Ủ đĩa trong 1 giờ ±5 phút ở nhiệt độ 37±3oC.
(3) Rửa nguyên liệu, pha lỗng dung dịch rửa thành 1/10 với nước cất hay nước khử khống; Di chuyển tấm film cẩn thận và rửa 04 lần.
(4)Conjugate: đầu tiên cần chuẩn bị conjugate bằng cách pha lỗng conjugate 1/10 chất pha lỗng conjugate. Chú ý hàm lượng phải là 2ml/strip; cĩ nghĩa là 200µl/1,8 ml CD. Sau đĩ, thêm 100 µl conjugate pha lỗng vào tất cả các giếng và phủ tấm film mới.
(6) Rửa: di chuyển tấm film cẩn thận và rửa 04 lần; Thêm 100µl chất nền peroxidase PS vào mỗi giếng. Khơng phủ film giai đoạn này. Trộn đều dung dịch bằng cách dùng máy lắc thủ cơng.
(7) Ủ chất nền: Ủ 30±5 phút; ở nhiệt độ phịng (20±5oC), tránh ánh sáng. (8) Thêm 50 µl dung dịch ngừng phản ứng (S) vào giếng. Trộn đều dung dịch bằng cách dùng máy lắc thủ cơng hay máy trộn để đảm bảo khơng cĩ bọt trong giếng.
(9)Đo mật độ quang học (OD) bằng biochromaticallly ở 450 và 630 nm (trong dải màu vàng). Nếu đọc bằng monochromatic, phải đảm bảo sạch đáy giếng trước khi đọc.
(10) Đọc kết quả
Đánh giá kết quả của giá trị test: Khi OD đối chứng dương ≥0,300; Khi OD đối chứng âm <0,50 x OP P và khi hệ số tương quan giữa ln ODs và nồng độ kháng thể bệnh dại đối với huyết thanh chuẩn WHO > 0,95.
Biểu diễn và giải thích kết quả: Dùng đường cong hồi qui để tính chuẩn độ; Tính giá trị OD trung bình của mỗi mẫu test và của mỗi pha lỗng huyết thanh WHO. Tính giá trị ln của mỗi OD trung bình và giá trị ln của nồng độ kháng thể bệnh dại cho mỗi pha lỗng WHO (từ 6,7 đến 0,0223IU/ml, mà khơng thuyết phục tính tốn 1/100 yếu tố pha lỗng test. Biễu diễn kết quả bằng biểu đồ ln (OD) (Y-axis) như chức năng của ln (nồng độ kháng thể bệnh dại) (X-axis) dựa vào Bảng vẽ đường cong tham chiếu so với huyết thanh chuẩn WHO (Hình 3.7).
Hình 3.8: Đường cong tham chiếu của huyết thanh chuẩn WHO
Dùng tất cả kết quả thu được đối với pha lỗng huyết thanh chuẩn WHO, thực hiện một đường cong hồi qui giữa nồng độ kháng thể bệnh dại (biểu diễn EU/ml, tương đương đơn vị/ml); và ln OD, thành lập mơ hình tốn học tương ứng: ln (nồng độ kháng thể bệnh dại (IU/ml) = a + b * ln OD
Mỗi mẫu test, tính giá trị OD trung bình và nồng độ kháng thể bệnh dại của mẫu được xác định bằng cơng thức: Nồng độ kháng thể bệnh dại mẫu (IU/ml) = e(a+b* ln OD). Nếu chuẩn độ >0,6 thì thú được xem như đã được bảo hộ (+) hoặc chuẩn độ <0,6 thì xem như thú khơng được bảo hộ (-).
3.4.4 Phương pháp khảo sát đáp ứng miễn dịch trên chĩ sau khi tiêm vaccine dại Rabisin và miễn dịch thụ động của chĩ con
Đánh giá đáp ứng miễn dịch trên chĩ sau tiêm phịng vaccine dại (Rabisin) tại Kiên Giang và miễn dịch thụ động của chĩ con qua xét nghiệm huyết thanh học bằng phản ứng ELISA gián tiếp với số mẫu được tính tối thiểu theo cơng thức của Thrusfield (2005) như sau:
= 2 = (1 − )
(1− /2)
2
Trong đĩ:
n: Cỡ mẫu yêu cầu
Z: Giá trị phân phối chuẩn (Z=1,96) với độ tin cậy (1-α/2 =95%) P: Tỷ lệ dương tính dự đốn (60%)
d: Độ tin cậy thiết kế (d=10%)
Theo cơng thức trên thì số lượng mẫu cần lấy là: N = [(1,96)2 x 0,6 (1- 0,6)]/0,12 = 92
Như vậy, số lượng mẫu cần lấy là 92. Nhưng số lượng mẫu huyết thanh chĩ thực tế lấy để xét nghiệm là 153. Kiên Giang là một tỉnh cĩ địa hình rất đa dạng, vừa cĩ đồng bằng vừa cĩ đồi núi và biển đảo. Tổng đàn chĩ tỉnh Kiên Giang đứng thứ hai ở vùng ĐBSCL và tỷ lệ tiêm phịng dại trên trên chĩ cịn ở mức thấp (8,34%) - Chi cục Thú y vùng VII năm 2015-2016), là một trong 3 tỉnh của vùng ĐBSCL (Kiên Giang, Đồng Tháp và Trà Vinh) cĩ nguy cơ bệnh dại trung bình của cả nước. Dựa vào các đặc điểm dịch tễ về bệnh dại tại Kiên Giang thì việc thu mẫu huyết thanh chĩ sau khi tiêm vaccine dại ở các giai đoạn (<6 tháng, 6 -12 tháng và >12 tháng) được bố trí như Bảng 3.5.
Bảng 3.5: Bố trí lấy mẫu xét nghiệm kháng thể sau tiêm phịng vaccine Rabisin tại tỉnh Kiên Giang
Quận, huyện Tổng số mẫu xét nghiệm
TP. Rạch Giá 18 Hà Tiên 15 Kiên Lương 24 Hịn Đất 39 Châu Thành 30 Vĩnh Thuận 27 Tổng cộng 153
Miễn dịch thụ động trên đàn chĩ con từ chĩ mẹ đã tiêm phịng vaccine dại Rabisin được đánh giá bằng cách tiến hành khảo sát 15 đàn chĩ, gồm 15 chĩ mẹ và 34 chĩ con ở các tỉnh Vĩnh Long, Hậu Giang, Cần Thơ, Đồng Tháp, Kiên Giang, Bến Tre và được bố trí cụ thể theo như Bảng 3.6.
Bảng 3.6: Bố trí lấy mẫu xét nghiệm kháng thể thụ động trên chĩ con
Địa phương Chĩ mẹ (con) Chĩ con xét nghiệm (con)
Vĩnh Long 2 8 Hậu Giang 1 2 Cần Thơ 2 5 Đồng Tháp 3 7 Kiên Giang 4 7 Bến Tre 3 5 Tổng cộng 15 34
Trong quá trình lấy mẫu tiến hành điều tra thu thập thêm những thơng tin về địa chỉ, lứa tuổi, giống, giới tính, thời điểm tiêm chủng… từ những chĩ được tiêm phịng ở các huyện/thành phố bằng phiếu lấy mẫu (Phụ lục 3).
3.4.5 Phương pháp đánh giá khả năng tồn trữ mầm bệnh dại ngồi tự nhiên và đề xuất các biện pháp phịng chống
Mẫu huyết thanh của chuột cống (Rattus norvegicus); sĩc nhen (Tamiops
maritimus) và Dơi ma nam (Megaderma spasma) được thu thập tại các tỉnh Kiên
Phương pháp thu thập mẫu: chuột, sĩc nhen được bắt bằng bẫy gặp (lồng); Dơi được bắt bằng cách giăng lưới. Các động vật hoang dã sau khi bắt sẽ tiến hành lấy máu, thu huyết thanh và đưa đi xét nghiệm tại các phịng thí nghiệm của Bộ mơn Thú y, trường Đại học Cần Thơ; Trung tâm nghiên cứu và phát triển cơng ty Vemedim Cần Thơ.
Mẫu huyết thanh được phân tích, đánh giá hàm lượng kháng thể dại bằng phương pháp dịch tễ học phân tích, xét nghiệm kháng thể bằng phản ứng ELISA gián tiếp, bộ kit sử dụng là SERELISA®Rabies Ab Mono Indirect (Pháp) và được đọc trên máy đo bước sĩng hiệu BIO-TEX (Mỹ) model Epoch.
Khi tiến hành lấy mẫu xét nghiệm cĩ thu thập thêm các thơng tin của mẫu bằng phiếu lấy mẫu máu đánh giá sự tồn tại của kháng thể dại ngồi tự nhiên (Phiếu 4, Phụ lục). Số lượng mẫu huyết thanh thu thập được trình bày cụ thể trong Bảng 3.7.
Bảng 3.7: Số mẫu động vật hoang xét nghiệm kháng thể kháng virus dại
Lồi Tổng số mẫu Kiên Giang Hậu Giang Vĩnh Long Cần Thơ
khảo sát
Chuột cống 92 32 30 - 30
Sĩc nhen 61 31 - - 30
Dơi 150 30 80 40 -
Tổng cộng 303 93 110 40 60
Kết quả xét nghiệm hàm lượng kháng thể dại cĩ trong các mẫu của động vật hoang dã được lưu trữ bằng phần mềm Excel và xử lý bằng trắc nghiệm χ2 (Chi - Square test) của phần mềm Minitab 16.0.
3.4.6 Phương pháp khảo sát mối tương quan di truyền giữa các chủng virus dại thực địa với chủng vaccine đang sử dụng và các chủng virus dại trong khu vực
3.4.6.1 Phương pháp xét nghiệm RT-PCR phát hiện một phần gen N virus dại (Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh)
a. Nguyên lý
RT-PCR là một phương pháp khuếch đại đoạn DNA bổ sung (cDNA) sau khi được tổng hợp từ RNA virus hiện diện trong bệnh phẩm. Các bước chính của kỹ thuật này bao gồm: (1) chiết xuất RNA virus, (2) tổng hợp sợi DNA từ khuơn mẫu RNA virus,
(3) khuếch đại đoạn DNA cĩ kích thước tương ứng đặc hiệu nhĩm Flavivirus, (4) khuếch đại đoạn DNA cĩ kích thước tương ứng đặc hiệu tube virus nhờ các cặp mồi đặc hiệu
b. Qui định về an tồn sinh học
Xử lý mẫu bệnh phẩm và các hĩa chất độc hại tuân theo quy chế quản lý chất thải y tế ban hành kèm quyết định 47/2007/QĐ-BYT ngày 30/11/2007 của Bộ Y tế Việt Nam.
c. Chi tiết mẫu ban đầu
Mẫu Vật chứa Phụ gia Thể tích Các yêu cầu Tiêu chuẩn
về lưu trữ/ loại bỏ vận chuyển
Dịch não Ống 3- 5 mL Khơng cĩ 0,5-5ml Ở -200
C
tủy, dịch EDTA hoặc (dưới 7 ngày)
nước nước các chất phụ hoặc - 30 đến