- /AIDS
4. Cơ chế nhuôm kháng nguyên bề mặt tế bào và quá trình thu nhận tín
4.2. Quá trình thu nhận tín hiệu
Tế bào/vật thể nhỏ khi di chuyển qua nguồn sáng sẽ tương tác với tia laser và sinh ra các tín hiệu sáng:
Kháng thể đơn dòng có gắn chất phát huỳnh quang sẽ gắn vào kháng nguyên tương ứng nằm trên tế bào đích trong quá trình ủ.
28 Đèn laser Thấu kính Kính lọc Kính lọc Kênh thu tín hiệu
Kênh thu tín hiệu
Hình 12. Hệ thống quang học và hệ thống điện tử thu nhận tín hiệu
Ánh sáng tán xạ góc thẳng sẽ được thu nhận qua các kênh FSC (Forward Scatter Chanel). Do được thu nhận thẳng góc (song song) với trục ánh sánh nguồn, ánh sáng tán xạ góc thẳng phản ánh kích thước tế bào/vật thể phân tích
(hình minh họa). Ánh sáng tán xạ góc bên sẽ được thu nhận qua kênh SSC (Side
Scatter Chanel). Do được thu nhận ở góc bên (90 độ) theo trục ánh sáng nguồn, ánh sáng tán xạ góc bên phản ánh độ phức tạp nhân và bào tương của tế bào.
Hình 13. Tán xạ ánh sáng tia laser theo trục thẳng và vuông góc tạo thông số FSC và SSC
Nếu tế bào có kích thước càng lớn, chỉ số FSC thu được càng lớn. Tế bào càng nhiều hạt hoặc khoang trong bào tương, nhân càng quận, chia múi thì chỉ số SSC càng cao. Như vậy, trong các thành phần bạch cầu có thể thấy chỉ số SSC của quần thể tế bào lympho là thấp nhất, của quần thể mono cao hơn quần thể lympho, và SSC của quần thể bạch cầu hạt đa nhân sẽ lớn nhất.
29
Hình 14. Đồ thị 2 chiều SSC và FSC của mẫu máu toàn phần đã ly giải hồng cầu cho thấy các quần thế tế bào bạch cầu được phân tách thành 3 quần thể rõ rệt
theo kích thước và mức độ phức tạp của cấu trúc bên trong tế bào.
Các tín hiệu màu huỳnh quang (FL-Fluoressent Light) từ phức hợp kháng thể kháng nguyên trên bề mặt tế bào đích cũng được thu nhận theo các kênh màu huỳnh quang và được khuếch đại trong các ống nhân quang PMTs (photomultipliers tube).
Khi tia laser chiếu vào các chất phát huỳnh quang này sẽ tạo ra các ánh sáng huỳnh quang và sau đó các tín hiệu sáng này sẽ được thu nhận, chuyển đổi thành tín hiệu điện tử và biểu thị dưới dạng biểu đồ gồm các quần thể dương tính và âm tính với các huỳnh quang tương ứng với các kháng nguyên cần khảo sát.
Hình 15. Hiển thị tín hiệu huỳnh quang trên máy tính phân tích.
. Thông thường các hãng khác nhau có đôi chút khác biệt trong việc bố trí đèn huỳnh quang và các hệ thống kính lọc, do vậy các kênh màu huỳnh quang
FITC FITC FITC FITC FITC FITC FITC FITC FITC FITC
Cường độ huỳnh quang
Số lượ ng tế bà o
Quần thể bạch cầu hạt trung tính có kích thước từ độ phức tạp nhân và bào tương đa dạng từ mức trung bình đến cao. Quần thể monocyte có kích thước lớn hơn lympho, độ phúc tạp nhân và bào tương ở mức trung bình thấp.
Quần thể lympho có kích thước nhỏ nhất, nhân và bào tương đơn giản nhất
Các tế bào không gắn hoặc gắn rất ít với kháng thể đơn dòng sẽ biểu hiện thành cột âm tính (góc trái) , quần thể tế bào gắn được nhiều kháng thể đơn dòng sẽ được biểu hiện thành cột dương tính (góc phải).
30
cũng có đôi chút khác biệt. Điều này cần chú ý vì sẽ liên quan đến việc lựa chọn phối hợp màu huỳnh quang trong các phân tích đa màu.
Tổng hợp các tín hiệu về ánh sáng tán xạ góc thẳng, ánh sáng tán xạ góc bên và các tín hiệu về ánh sáng huỳnh quang tương ứng của một tế bào sẽ giúp chúng ta phân biệt tế bào này với các nhóm tế bào khác trong quần thể. Ngoài ra, việc khoanh vùng (gating) quần thể mong muốn còn giúp thực hiện thống kê hoặc tiếp tục phân tích sâu hơn.