Đánh giá sự hình thành steroid do eCG trong tế bào mLTC-1 và tế bào

5. Những đóng góp mới của đề tài

3.5. Đánh giá sự hình thành steroid do eCG trong tế bào mLTC-1 và tế bào

Leydig tinh hoàn khi ức chế hoạt động của AC hòa tan.

2.4. Phương pháp nghiên cứu

2.4.1. Phương pháp nuôi cấy tế bào mLTC-1.

Tế bào mLTC-1 nuôi cấy sau khi được rã đông từ nitơ lỏng (-196°C) sẽ được nuôi cấy trong hộp nhựa 25cm2

trong môi trường RPMI 1640 có bổ sung huyết thanh bò 1 tuần trước khi cấy truyền vào các giếng trên một đĩa nuôi cấy 96 lỗ, sau đó mang ủ ở 37°C với 5% CO2 trong vòng 48 tiếng. Trong quá trình nuôi cấy lần một trong hộp nhựa, chúng ta cần thay môi trường sau 3 ngày và trong lần cấy truyền lần hai trong đĩa 96 lỗ thì thay môi trường sau 24 giờ nuôi cấy.

2.4.2. Đánh giá khả năng sống của tế bào

Các tế bào mLTC-1 được tra vào đĩa nuôi cấy gồm 96 giếng với số lượng khoảng 100.000 tế bào/giếng. Sau 48 giờ nuôi cấy ở nhiệt độ 37°C, môi trường được thay thế bằng môi trường không có huyết thanh và có bổ sung KH7, 2-CE, 4-CE (0 – 100μM). Đĩa tế bào được ủ thêm 1 giờ ở nhiệt độ 37°C trước khi thêm 20μl CellTiter-Blue Reagent vào mỗi giếng. Sau đó ủ thêm 2 giờ ở 37°C để chất huỳnh quang thấm vào tế bào, những thay đổi trong huỳnh quang sau đó sẽ được ghi lại bằng máy đo quang phổ Spectra Gemini (Thiết bị phân tử, Sunnyvale, CA) ở bước sóng kích thích 560nm và bước sóng phát xạ là 640nm. Tín hiệu huỳnh quang từ thuốc thử CellTiter-Blue tỷ lệ thuận với số lượng tế bào sống sót.

2.4.3. Phương pháp xác định nồng độ cAMP

Tế bào mLTC-1 được transfected với Glosensor-TM-22F cyclic AMP plasmid, sử dụng chất vận chuyển X-treme GENETM-HP-DNA. Plasmid này bao gồm trình tự gen mã hóa luciferase của đom đóm dung hợp với vùng liên kết cAMP của gen mã hóa protein kinase A cho phép kiểm soát hoạt động enzyme bằng cAMP. Các đĩa sau đó được ủ qua đêm ở 37°C dưới 5% CO2 trước khi sử dụng các tế bào trong các xét nghiệm.

Sau đó dịch môi trường transfection được loại bỏ và thay thế bằng môi trường RPMI 1640 không có huyết thanh và chứa cơ chất của luciferase là luciferin có bổ sung IBMX (3-isobutyl-1-methylxanthine). Tế bào sau đó được ủ ở 28°C 1 giờ trước khi bổ sung các chất KH7, 2-CE, 4-CE, ở các nồng độ khác nhau (0 – 100μM), khi bổ sung KH7, 2-CE, 4-CE thì phải ủ thêm 1 giờ. Cuối cùng, kích thích bằng eCG (10µl/giếng tương đương với nồng độ 0,7nM) trước khi quan sát nồng độ cAMP bằng máy đo quang phổ huỳnh quang.

Hình 2.1. Cơ chế hoạt động của Glosensor và Luciferin trong phản ứng tạo cAMP

2.4.4. Phương pháp xác định nồng độ Progesterone

Nồng độ progesterone được đo ở phần nổi trên bề mặt của tế bào mLTC- 1 ủ cùng với eCG trong môi trường nuôi cấy RPMI 1640. Các tế bào mLTC-1 được nuôi cấy vào các đĩa gồm 96 giếng (100.000 tế bào/giếng) trong ba ngày và sau đó được thay môi trường bằng môi trường RPMI 1640 không có huyết thanh và được ủ khi có hoặc không có KH7, 2-CE, 4-CE (0 - 100μM) trong 2 giờ. Sau đó, đĩa tế bào sẽ được bổ sung eCG (10µl/giếng tương đương với nồng độ 0,7nM) và ủ thêm 3 giờ. Những môi trường nổi trên bề mặt sau đó sẽ được thu thập và lưu trữ ở -200C cho đến khi phân tích.

Nồng độ progesterone sản xuất ra trong tế bào được đo bằng xét nghiệm ELISA. Một đĩa 96 giếng được ủ qua đêm ở 40C với kháng thể IgG (10ng/giếng). Sau ba lần rửa với PBS 1X chứa 0,1% Tween 20, các vị trí không đặc hiệu sẽ được bão hòa 1 giờ với 200μl/giếng PBS-Tween 20 bổ sung 0,2% BSA. Rã đông tự nhiên môi trường thu được đã bảo quản ở -200

C và tra vào các giếng để tiến hành đo nồng độ progesterone. Progesterone-11-

Hemisuccine-HRP đã được thêm vào cùng với kháng thể kháng P4 (36ng/giếng). Đĩa tế bào sau đó được ủ trong 4 giờ ở nhiệt độ phòng, được rửa lại 3 lần với dung dịch PBS 1X chứa 0,1% Tween 20 trước khi tra TMB vào đĩa với 100μl/giếng. Đĩa tế bào tiếp tục được ủ thêm 20 phút ở nhiệt độ phòng trong bóng tối. Phản ứng được dừng lại khi bổ sung H2SO4 2N và nồng độ progesterone được đo ở bước sóng 450nm.

2.4.5. Phương pháp Western-Blotting

Nồng độ protein của tế bào mLTC-1 trong mỗi phần nổi trên mặt được xác định bằng một xét nghiệm so màu (Bio-Rad DC Protein Assay; Bio-Rad, Hercules, CA). Các protein được điện di bằng gel SDS-PAGE 10% (Polyacrylamide Gel Electrophoresis) và sau đó được chuyển vào màng nitrocellulose (Whatman Protran, Dassel, Germany). Màng được chặn bằng đệm chặn và được ủ với kháng thể đặc hiệu ADCY10 (48kDa), được pha loãng trong BSA 5% trong TBS-Tween 0,1% (độ pha loãng cuối cùng 1: 1000) qua đêm ở 40C. Cuối cùng, các màng này được ủ tiếp trong 1 giờ trong IgG kháng thể thỏ (H + L) (CF770 Conjugate) (độ pha loãng cuối cùng 1: 2000). Các màng sau đó được quét trên hệ thống hình ảnh LI-COR Bioscience Odyssey CLx (Lincoln, Hoa Kỳ).

2.4.6. Phương pháp miễn dịch huỳnh quang

Các tế bào mLTC-1 được rửa với dung dịch muối đệm PBS, cố định trên lame kính bằng paraformaldehyde (4%) trong 4 phút. Sau đó, các tế bào được rửa trong PBS (3 lần x 3 phút) và sau đó ủ 10 phút với 0,5% Triton X- 100 trong PBS. Các liên kết không đặc hiệu đã bị chặn với PBS bổ sung 10% huyết thanh lừa (Eurobio, Courtaboeuf, Pháp) trong 30 phút ở nhiệt độ phòng. Các mẫu sau đó được ủ qua đêm ở 40C với kháng thể đặc hiệu ADCY10. Sau 3 lần rửa với PBS, các tế bào được ủ với các kháng thể thứ cấp IgG thỏ kèm

FluoProbes 448 trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng trong bóng tối, rửa lại (3 lần x 3 phút) với PBS và ủ với 4', 6'-diamidino-2-phenylindole (DAPI) trong 10 phút. Sự có mặt của ADCY10 trong tế bào đã được kiểm tra bằng kính hiển vi confocal Zeiss LSM 700. Đối chứng được thực hiện bằng cách bỏ các kháng thể chính. Phân tích hình ảnh được thực hiện bằng phần mềm IMAGEJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/).

2.4.7. Xác định mức năng lượng ATP trong tế bào

Các tế bào mLTC-1 được tra vào đĩa nuôi cấy gồm 96 giếng với số lượng khoảng 100.000 tế bào/giếng. Sau 48 giờ nuôi cấy ở nhiệt độ 37°C, môi trường được thay thế bằng môi trường không có huyết thanh và có bổ sung KH7, 2-CE, 4-CE (0 – 100μM). Đĩa tế bào được ủ thêm 1 giờ ở nhiệt độ 37°C trước khi thêm 50μl Cell-Titer-Glo 2.0 Assay Promega vào mỗi giếng. Sau đó đĩa tế bào được lắc đều với vận tốc nhẹ trong 10 phút trong tối và ủ thêm 2 phút ở nhiệt độ phòng trước khi ghi lại sự phát quang của thuốc thử Cell- Titer-Glo 2.0. Giá trị cường độ phát quang thu được tương đương với giá trị nồng độ ATP trong tế bào sống. ATP standard được pha trong dung môi Cell- Titer-Glo 2.0 Assay Promega với các nồng độ quy định là 10-10, 10-11, 10-12 .

Chú ý trước khi tiến hành thí nghiệm, bộ kit thuốc thử Cell-Titer-Glo 2.0 Assay Promega cần được rã đông chậm tại nhiệt độ phòng tối đa 4 tiếng, không lắc mạnh thuốc thử, không được rã đông bằng nước nóng.

Hình 2.2. Cơ chế phản ứng phát quang của Luciferin trong Cell- Titer-Glo 2.0 dưới xúc tác của enzyme luciferase và ion Mg2+

2.4.8. Phương pháp xử lý các số liệu

Kết quả được biểu diễn dưới dạng TB ± SE (TB: giá trị trung bình của từng lô, SE: sai số chuẩn). Xử lý số liệu bằng phần mềm GRAPHPAD PRISM (test thống kê Anova) để so sánh sự khác biệt giữa các thí nghiệm. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi p<0,05.

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Xác định vị trí AC hòa tan trong tế bào mLTC-1.

Dòng tế bào Leydig mLTC-1 từ chuột đã được thiết lập từ nhiều năm trước từ mô khối u Leydig có kí hiệu là M548OP thuộc Viện Nghiên cứu Ung thư Papanicolaou của Mỹ. Sau nhiều lần cấy ghép liên tiếp ở chuột đực có kí hiệu là C57B1/6J, mô khối u sẽ được tách ra khỏi cơ thể chuột và được đông lạnh trong môi trường 199 (Gibco) chứa 20% huyết thanh và 10% glycerol và được bảo quản trong nitơ lỏng [18].

Tế bào mLTC-1 nuôi cấy sau khi được rã đông từ nitơ lỏng (-1960C) sẽ được nuôi cấy trong hộp nhựa 25cm2

trong môi trường RPMI 1640 có bổ sung huyết thanh bò 1 tuần trước khi cấy truyền vào các giếng trên một đĩa nuôi cấy 96 lỗ, sau đó mang ủ ở 370C với 5% CO2 trong vòng 48 tiếng. Sau đó sử dụng phương pháp Western blot và miễn dịch huỳnh quang gián tiếp để xác định sự hiện diện của adenylate cyclase hòa tan (AC hòa tan) trong tế bào mLTC-1, sử dụng các kháng thể chính đặc hiệu ADCY10.

Phương pháp Western blot cho thấy AC hòa tan trong tế bào mLTC-1 được phát hiện ở 1 dải có khối lượng 48kDa (Hình 3.1a). Kết quả miễn dịch huỳnh quang chỉ ra rằng AC hòa tan xuất hiện liên tục trong tế bào chất của tế bào mLTC-1 (màu xanh lá cây) (Hình 3.1b). Mẫu đối chứng được thực hiện bằng cách bỏ qua xử lý với kháng thể AC hòa tan (anti-ADCY10) không cho hiển thị màu xanh lá cây (Hình 3.1c).

Kết quả Western blot cũng không cho thấy xuất hiện băng protein ngoại lai. Điều này cho thấy kháng thể ADCY10 là đặc hiệu. Màu xanh dương hiển thị nhân tế bào được nhuộm bằng chất huỳnh quang DAPI. Như vậy kết quả thí nghiệm của chúng tôi đã xác định được sự có mặt của protein adenylyl cyclase hòa tan trong tế bào chất của tế bào Leydig mLTC-1.

Hình 3.1. Phản ứng miễn dịch huỳnh quang của adenylyl cyclase hòa tan trong tế bào mLTC-1

(a) Kết quả Western blotđược thăm dò với kháng thể ADCY10.

(b) Miễn dịch huỳnh quang gián tiếp của tế bào mLTC-1 được thực hiện với cùng một kháng thể ADCY10 nhuộm với chất nhuộm huỳnh quang màu xanh lá cây. Nhân sẽ được nhuộm màu xanh dương với DAPI.

(c) Đối chứng bỏ qua kháng thể thì không xuất hiện huỳnh quang màu xanh lá cây, nhân được nhuộm màu xanh dương với DAPI.

3.2. Đánh giá nồng độ cAMP nội bào dưới kích thích của eCG chuỗi đơn tái tổ hợp trong tế bào mLTC-1. tái tổ hợp trong tế bào mLTC-1.

cAMP là một chất truyền tin thứ hai hiện diện ở tất cả các cơ quan trong cơ thể và tham gia vào vô số các quá trình điều hòa của tế bào. Sự hình thành cAMP thường phụ thuộc vào sự hoạt hóa protein G. Nồng độ cAMP gia tăng nhanh chóng và thực hiện chức năng khác nhau, trong đó, chức năng chính của cAMP là hoạt hóa protein kinase, PKA, để phosphoryl hóa một lượng lớn các yếu tố trung gian. cAMP có thể được tạo thành từ sự kích thích của rất nhiều tác nhân khác nhau, mà thông thường là neurotransmitter và hormones.

Thực hiện kiểm tra hoạt động của adenylyl cyclase hòa tan bằng cách đánh giá tác động của các chất ức chế của nó đối với sự tổng hợp cAMP do eCG kích thích trong tế bào. Các tế bào mLTC-1 được chuyển nạp plasmid Glosensor-TM-22F cyclic AMP, sử dụng chất vận chuyển X-treme GENETM-HP-DNA có bổ sung IBMX (3-isobutyl-1-methylxanthine). Plasmid này bao gồm trình tự gen mã hóa luciferase của đom đóm dung hợp với vùng liên kết cAMP của gen mã hóa protein kinase A cho phép kiểm soát hoạt động enzyme thông qua nồng độ cAMP tạo thành.

Trong nghiên cứu này, để đánh giá khả năng kích thích của eCG tái tổ hợp chuỗi đơn tạo ra cAMP khi ức chế adenylyl cyclase hòa tan (AC hòa tan) bằng các chất ức chế đặc biệt của nó như KH7, 2-CE, 4-CE. Để xác định xem KH7, 2-CE, 4-CE có ảnh hưởng đến phản ứng cAMP đối với hormone eCG tại nồng độ 0,7nM (10µl/giếng) hay không, các tế bào mLTC-1 đã được xử lý trước trong 1 giờ khi không có (đối chứng, 0µM) hoặc có sự hiện diện của KH7, 2-CE, 4-CE ở các nồng độ khác nhau trước khi bổ sung hormone eCG.

Kết quả tại hình 3.2 cho thấy rằng tại mẫu đối chứng khi không ủ chất ức chế KH7, 2-CE, 4-CE với tế bào thì eCG đã kích thích phản ứng tổng hợp cAMP trong tế bào. Cường độ tín hiệu của luciferase phát ra thể hiện qua các đường cong đồ thị chính là nồng độ cAMP tạo ra sau phản ứng. Khi xử lý chất ức chế KH7, 2-CE, 4-CE với tế bào 1 giờ trước khi kích thích với eCG thì cường độ tín hiệu phát ra giảm và sự giảm này phụ thuộc vào liều. Chúng tôi cũng đã quan sát kết quả tương tự đối với các khu vực dưới các đường cong (AUC). Sau 1 giờ ủ với KH7, 2-CE, 4-CE thì nồng độ cAMP nội bào được tạo ra khi kích thích bởi eCG giảm có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với đối chứng không có KH7, 2-CE, 4-CE tại nồng độ 25, 50, và 100µM. Những nồng độ còn lại chúng tôi không quan sát thấy có sự thay đổi so với đối chứng. Ở nồng độ 100µM, KH7 gần như loại bỏ hoàn toàn các phản ứng tổng

hợp cAMP do eCG kích thích (Hình 3.2a), 2-CE giảm khoảng 70% (Hình 3.2b), 4-CE khoảng 80% (Hình 3.2c).

Hình 3.2. Ảnh hưởng của KH7, 2-CE, 4-CE đến nồng độ cAMP nội bào dưới tác động kích thích của eCG trong các tế bào mLTC-1

cAMP được thể hiện thông qua cường độ phát quang của oxiluciferin. Giá trị AUC được chuyển đổi từ khu vực đường cong của cường độ phát quang của oxiluciferin. Lượng eCG được tra vào mỗi giếng trên đĩa 96 giếng là giống nhau 0,7nM. Các thí nghiệm được lặp lại 4 lần; giá trị trung bình ± SE. Các chữ cái khác nhau chỉ ra sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa đối chứng (0µM) và mẫu thí nghiệm ở p<0,05.

Các chất ức chế AC hòa tan được phát hiện trong nghiên cứu của chúng tôi, KH7, 2-CE, 4-CE, cho thấy sự ức chế mạnh mẽ hoạt động đến AC hòa tan thông qua việc ức chế mạnh sự tổng hợp cAMP do eCG kích thích trong các tế bào mLTC-1. Tuy nhiên, hiệu quả ức chế của các hợp chất là khác nhau, KH7 có tác dụng ức chế AC hòa tan mạnh nhất và tiếp đến là 4-CE và 2-CE.

Những nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng cả 3 hợp chất KH7, 2-CE, 4-CE đều ức chế sản xuất ATP của ti thể nhưng theo các cơ chế khác nhau. Nhóm chất ức chế CE dường như ức chế sản xuất ATP bằng cách giảm hoạt động hô hấp và KH7 dường như ức chế sản xuất ATP bằng cách giảm hô hấp ở nồng độ thấp hơn và bằng cách xáo trộn điện thế màng ở nồng độ cao hơn [20]. Ngoài ra, CE được biết là nhóm chất ức chế AC hòa tan nhưng cũng có thể ức chế AC xuyên màng [21], [22], [23]. Chúng làm như vậy bằng cách liên kết với khe hở kỵ nước khác với các vị trí hoạt động và chelat hóa bề mặt kim loại đồng quan trọng [23]. Liên kết catechol là liên kết kim loại hóa trị hai quan trọng làm biến dạng vị trí hoạt động. Do yêu cầu đối với 2 kim loại hóa trị hai và túi kỵ nước liên kết CE được bảo toàn trong AC hòa tan và AC xuyên màng của động vật có vú, nên CE ức chế cả hai họ adenylyl cyclase trong ống nghiệm là có cơ sở [23]. KH7 ức chế sự tích tụ cAMP phụ thuộc AC hòa tan mà không ảnh hưởng đến AC xuyên màng, giảm sản xuất cAMP trong tế bào 4-4 với IC50 là 27 và không ảnh hưởng đến sự tích tụ cAMP phụ thuộc vào AC xuyên màng, trong khi AC hòa tan-KO-MEF được forskolin kích thích [21]. Tuy nhiên, KH7 có tác dụng phụ đối với sự trao đổi chất của

tế bào β, hạn chế tính hữu ích của nó trong các nghiên cứu AC hòa tan trong toàn bộ tế bào [24]. Như vậy, để đánh giá chính xác về cơ chế tác động KH7, 2-CE, 4-CE đến adenylyl cyclase hòa tan thông qua sự giảm cAMP nội bào, chúng tôi quyết định kiểm tra thêm sự ảnh hưởng của các chất ức chế này đến