5. Những đóng góp mới của đề tài
2.4.4. Phương pháp xác định nồng độ Progesterone
Nồng độ progesterone được đo ở phần nổi trên bề mặt của tế bào mLTC- 1 ủ cùng với eCG trong môi trường nuôi cấy RPMI 1640. Các tế bào mLTC-1 được nuôi cấy vào các đĩa gồm 96 giếng (100.000 tế bào/giếng) trong ba ngày và sau đó được thay môi trường bằng môi trường RPMI 1640 không có huyết thanh và được ủ khi có hoặc không có KH7, 2-CE, 4-CE (0 - 100μM) trong 2 giờ. Sau đó, đĩa tế bào sẽ được bổ sung eCG (10µl/giếng tương đương với nồng độ 0,7nM) và ủ thêm 3 giờ. Những môi trường nổi trên bề mặt sau đó sẽ được thu thập và lưu trữ ở -200C cho đến khi phân tích.
Nồng độ progesterone sản xuất ra trong tế bào được đo bằng xét nghiệm ELISA. Một đĩa 96 giếng được ủ qua đêm ở 40C với kháng thể IgG (10ng/giếng). Sau ba lần rửa với PBS 1X chứa 0,1% Tween 20, các vị trí không đặc hiệu sẽ được bão hòa 1 giờ với 200μl/giếng PBS-Tween 20 bổ sung 0,2% BSA. Rã đông tự nhiên môi trường thu được đã bảo quản ở -200
C và tra vào các giếng để tiến hành đo nồng độ progesterone. Progesterone-11-
Hemisuccine-HRP đã được thêm vào cùng với kháng thể kháng P4 (36ng/giếng). Đĩa tế bào sau đó được ủ trong 4 giờ ở nhiệt độ phòng, được rửa lại 3 lần với dung dịch PBS 1X chứa 0,1% Tween 20 trước khi tra TMB vào đĩa với 100μl/giếng. Đĩa tế bào tiếp tục được ủ thêm 20 phút ở nhiệt độ phòng trong bóng tối. Phản ứng được dừng lại khi bổ sung H2SO4 2N và nồng độ progesterone được đo ở bước sóng 450nm.