5. Những đóng góp mới của đề tài
1.3. Tế bào Leydig mLTC-1
Dòng tế bào Leydig mLTC-1 từ chuột đã được thiết lập từ nhiều năm trước từ mô khối u Leydig có kí hiệu là M548OP thuộc Viện Nghiên cứu Ung thư Papanicolaou của Mỹ [18]. Sau nhiều lần cấy ghép liên tiếp ở chuột đực có kí hiệu là C57B1/6J, mô khối u sẽ được tách ra khỏi cơ thể chuột và được đông lạnh trong môi trường 199 (Gibco) chứa 20% huyết thanh và 10% glycerol và được bảo quản trong nitơ lỏng. Đây là dòng tế bào đã được rất nhiều nhà nghiên cứu quan tâm nghiên cứu về sự liên kết giữa hCG với các thụ thể LHR và sự sản sinh steroid hormone dưới sự kiểm soát của những hormone điều hòa tuyến sinh dục do thùy trước tuyến yên tiết ra. Chúng ta biết rằng tế bào tinh hoàn Leydig có một lượng thụ thể khá thấp, và một con số cao hơn nhiều chắc chắn sẽ ảnh hưởng đến phương thức kích hoạt con đường cAMP bởi các hormone có hoạt động LH khác nhau và phương thức có thể được điều khiển bởi các con đường khác [18].
Sự hiểu biết hiện tại về chức năng của tế bào Leydig và sự điều hòa của nó đã được thực hiện nhờ sự phát triển của các phương pháp thực nghiệm mà
qua đó, tế bào Leydig có thể được kiểm tra cả in vivo và in vitro, cũng như thông qua việc sử dụng các dòng tế bào. Hormone tạo hoàng thể (LH) do tuyến yên tiết ra để đáp ứng với hormone giải phóng gonadotropin (GnRH) từ vùng dưới đồi, bắt đầu hình thành steroid bằng cách liên kết với thụ thể LH của tế bào Leydig (LHR), thông qua kết hợp với protein G, kích thích tế bào Leydig hoạt động theo chu kỳ sản xuất adenosine 3', 5'-monophosphate (cAMP). Đến lượt mình, AMP vòng (cAMP) kích thích sự chuyển vị cholesterol từ các nguồn nội bào vào ty thể, bước quyết định tốc độ hình thành steroid. Tiếp theo là sự hình thành pregnenolone từ cholesterol trong ty thể, và sau đó chuyển hóa thành testosterone nhờ các enzyme của lưới nội chất trơn. Suy giảm sản xuất testosterone xảy ra khi lão hóa và các tình trạng khác, dẫn đến giảm nồng độ testosterone trong huyết thanh (thiểu năng sinh dục) và kèm theo những thay đổi về trao đổi chất và chất lượng cuộc sống. Liệu pháp thay thế testosterone (TRT) có sẵn và được sử dụng rộng rãi để nâng cao nồng độ testosterone trong huyết thanh ở nam giới suy giảm chức năng sinh dục. Kiến thức về các cơ chế liên quan đến sự hình thành testosterone cũng giúp chúng ta có thể hình dung được việc sử dụng các phương tiện dược lý để tăng testosterone trong huyết thanh (và trong tế bào) bằng cách kích thích chính các tế bào Leydig [19].
Hình 1.9. Tế bào Leydig mLTC-1
Hiện nay, có rất nhiều nghiên cứu khám phá về các hormone và enzyme liên quan đến quá trình sinh tổng hợp testosterone trong các tế bào Leydig. Testosterone của tinh hoàn được sản xuất ở vùng dưới đồi của tuyến yên. GnRH liên kết với các thụ thể màng trên tế bào sinh dục và kích thích sinh tổng hợp và bài tiết LH. LH gắn LHR trên bề mặt của tế bào Leydig và kích thích các dòng tín hiệu nội bào. Dufau và Catt đã chứng minh rằng phản ứng của thụ thể màng Leydig với LH sẽ kích thích hoạt động của adenylyl cyclase tạo ra cAMP và kích hoạt protein kinase PKA. Con đường cAMP, thông qua protein kinase A (PKA), có tầm quan trọng thiết yếu trong việc hình thành steroid nhờ kích thích của nó đối với sự chuyển vị của cholesterol đến màng ngoài ti thể. Cholesterol có thể được tổng hợp từ axetat và được lưu trữ trong các giọt lipid, hoặc nó có thể đến từ màng tế bào Leydig bao gồm cả màng sinh chất. Cơ chế điều hòa của quá trình sinh steroid là do LH (hoặc gonadotropin màng đệm ở người, hCG), liên kết với thụ thể liên kết với protein G và kích hoạt adenylate cyclase, dẫn đến sản xuất cAMP và sau đó kích hoạt protein kinase phụ thuộc cAMP. Điều này dẫn đến việc bắt đầu giải
phóng cholesterol từ các giọt lipid hoặc từ màng sinh chất. Sau đó, cholesterol được chuyển từ bên ngoài vào bên trong màng ti thể, nơi nó được chuyển thành pregnenolone bởi enzyme CYP11A. Ngoài ra, sự kích thích của tế bào Leydig bởi LH và cAMP là điều cần thiết để điều chỉnh mức độ biểu hiện của các protein và enzyme liên quan đến sự hình thành steroid, và do đó đối với sự điều hòa dinh dưỡng của sự hình thành steroid, chịu trách nhiệm sản xuất bền vững steroid trong một thời gian dài.
Năm 1975, Cooke và cộng sự chỉ ra rằng sự ức chế tổng hợp protein ảnh hưởng đến quá trình sản xuất steroid do LH của tế bào Leydig. Bốn năm sau, phòng thí nghiệm Cooke đề xuất rằng LH ảnh hưởng đến sự ổn định của một protein điều hòa liên quan đến sự hình thành steroid, việc xác định nó vẫn chưa được biết đến. Cuối cùng, vào năm 1991, Orme-Johnson và các đồng nghiệp đã mô tả một phosphoprotein 30kDa do LH gây ra trong các tế bào sinh steroid, bao gồm cả tế bào Leydig của chuột, mức độ này tăng lên song song với việc sản xuất steroid. Protein được tìm thấy là khu trú trong ti thể và sau đó được chứng minh là kết quả của sự phân cắt của một protein tiền thân 37kDa. Protein đã được nhân bản và được đặt tên là protein điều hòa cấp tính steroidogenic (StAR). Các nghiên cứu chi tiết đã chứng minh rằng StAR hoạt động tại ti thể để kích hoạt sự di chuyển của cholesterol qua màng. Quá trình phosphoryl hóa StAR phụ thuộc PKA được chứng minh là rất quan trọng đối với chức năng của nó. Sự cảm ứng nhanh chóng của sự hình thành StAR bởi LH và quá trình xử lý và mục tiêu của nó ở màng ngoài ty thể làm tăng sự hình thành testosterone.
Tầm quan trọng của StAR được thể hiện rõ ràng khi quan sát thấy các đột biến của gen StAR dẫn đến sự thiếu hụt nghiêm trọng mineralocorticoid và, nhất quán với điều này, có những khiếm khuyết nghiêm trọng trong steroid tuyến thượng thận được thấy ở chuột loại bỏ gen StAR. Chuyển gen
StAR được tìm thấy để khôi phục chức năng sinh steroid cho chuột. Hormone gonadotropin ở chuột loại trực tiếp không khác biệt đáng kể so với nồng độ có ở những con giống hoang dã. Điều này cho thấy rằng mặc dù việc sản xuất steroid tuyến thượng thận bị giảm đáng kể ở chuột loại bỏ gen StAR, những con chuột này vẫn giữ được khả năng sinh tổng hợp androgen của chúng. Tuy nhiên, những con chuột bị thiếu StAR được báo cáo có biểu hiện cơ quan sinh dục ngoài giống con cái, cho thấy tác động có thể có của StAR đối với việc sản xuất androgen của tinh hoàn thai nhi [19].
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU