5. Những đóng góp mới của đề tài
3.1. Xác định vị trí AC hòa tan trong tế bào mLTC-1
Dòng tế bào Leydig mLTC-1 từ chuột đã được thiết lập từ nhiều năm trước từ mô khối u Leydig có kí hiệu là M548OP thuộc Viện Nghiên cứu Ung thư Papanicolaou của Mỹ. Sau nhiều lần cấy ghép liên tiếp ở chuột đực có kí hiệu là C57B1/6J, mô khối u sẽ được tách ra khỏi cơ thể chuột và được đông lạnh trong môi trường 199 (Gibco) chứa 20% huyết thanh và 10% glycerol và được bảo quản trong nitơ lỏng [18].
Tế bào mLTC-1 nuôi cấy sau khi được rã đông từ nitơ lỏng (-1960C) sẽ được nuôi cấy trong hộp nhựa 25cm2
trong môi trường RPMI 1640 có bổ sung huyết thanh bò 1 tuần trước khi cấy truyền vào các giếng trên một đĩa nuôi cấy 96 lỗ, sau đó mang ủ ở 370C với 5% CO2 trong vòng 48 tiếng. Sau đó sử dụng phương pháp Western blot và miễn dịch huỳnh quang gián tiếp để xác định sự hiện diện của adenylate cyclase hòa tan (AC hòa tan) trong tế bào mLTC-1, sử dụng các kháng thể chính đặc hiệu ADCY10.
Phương pháp Western blot cho thấy AC hòa tan trong tế bào mLTC-1 được phát hiện ở 1 dải có khối lượng 48kDa (Hình 3.1a). Kết quả miễn dịch huỳnh quang chỉ ra rằng AC hòa tan xuất hiện liên tục trong tế bào chất của tế bào mLTC-1 (màu xanh lá cây) (Hình 3.1b). Mẫu đối chứng được thực hiện bằng cách bỏ qua xử lý với kháng thể AC hòa tan (anti-ADCY10) không cho hiển thị màu xanh lá cây (Hình 3.1c).
Kết quả Western blot cũng không cho thấy xuất hiện băng protein ngoại lai. Điều này cho thấy kháng thể ADCY10 là đặc hiệu. Màu xanh dương hiển thị nhân tế bào được nhuộm bằng chất huỳnh quang DAPI. Như vậy kết quả thí nghiệm của chúng tôi đã xác định được sự có mặt của protein adenylyl cyclase hòa tan trong tế bào chất của tế bào Leydig mLTC-1.
Hình 3.1. Phản ứng miễn dịch huỳnh quang của adenylyl cyclase hòa tan trong tế bào mLTC-1
(a) Kết quả Western blotđược thăm dò với kháng thể ADCY10.
(b) Miễn dịch huỳnh quang gián tiếp của tế bào mLTC-1 được thực hiện với cùng một kháng thể ADCY10 nhuộm với chất nhuộm huỳnh quang màu xanh lá cây. Nhân sẽ được nhuộm màu xanh dương với DAPI.
(c) Đối chứng bỏ qua kháng thể thì không xuất hiện huỳnh quang màu xanh lá cây, nhân được nhuộm màu xanh dương với DAPI.