I .2.2.4 Tính chất của saponin
I.4.2. Các nghiên cứu trong nước
Nước ta hiện nay có một số nghiên cứu như: Phạm Kim Mãn đã chứng minh cao chiết với cồn từ lá đu đủ có tác dụngức chếsựphát triển u báng gây bởi tếbào UT Sarcoma TG–180ở chuột nhắt trắng [20].
Theo nghiên cứu mới nhất của nghiên cứu sinh Hồ Thị Hà, Viện Công nghệ
Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, thì kết quả
sàng lọc hoạt tính gây độc tếbào của các phân đoạn chất chiết cho thấy rằng: thửhoạt
tính gây độc tế bào, hoạt tính enzyme caspase 3 và 7 trên dòng tế bào ung thư phổi LU-1, hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định và thửhoạt tính chống oxy hóa của một số
hợp chất chiết tách từ lá đu đủ (gồm: acid pluchoic, danielone, apocynol A, carpaine, pseudocarpaine), các tác giả đã đưa ra được các kết quả: có hai hợp chất carpaine và pseudocarpaine thể hiện hoạt tính gây độc đối với tế bào ung thư rất mạnh (IC50 từ
cũng gây độc với tế bào thường 3T3, bên cạnh đó, hai hợp chất này còn thể hiện khả năng kích hoạt enzym caspase 3 và 7ởnồng độthửcao nhất [3].
Theo Phùng Thị Thùy, Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm,
Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội,đã tiến hành nghiên cứu một sốhoạt tính sinh học của dịch chiết lá đu đủ. Trong nghiên cứu này tác giả chiết các chất hòa tan trong
nước, các hợp chất carotenoid, các hợp chất phân cực có trong lá đu đủ trồng tại Việt Nam và thử nghiệm khả năng tiêu diệt tế bào ung thư cũng như kiểm tra một sốhoạt tính sinh học khác của dịch chiết thu được. Kết quả cho thấy tất cả các dịch chiết thu
được đều có hoạt tính chống ô xy hóa mạnh hơn so với chất đối chứng là vitamin C ở
nồng độ tương ứng. Thử nghiệm khả năng ức chế tế bào ung thư cho thấy ở nồng độ
100µg/ml, các dịch chiết thu được đều có khả năng ức chếtế bào ung thư phổi LU–1 từ43,47% (các chất hòa tan trong nước) đến 62,88% (các chất phân cực). Trên dòng tế bào ung thư biểu mô KB khả năng ức chế của các dịch chiết này thấp hơn 2,8% (các
chất phân cực) và 20,6% (các chất hòa tan trong nước). Trên dòng tế bào ung thư vú
MCF7 khả năng ức chế của các dịch chiết này cũng khá cao từ 33,95% đến 56,19%. Trên dòng tế bào ung thư máu HL 60 hoạt tính ức chếcủa các dịch chiết này cũng thể
hiện cao từ 39,56-60,64%. Tuy nhiên khi thử nghiệm trên tế bào gốc (ESC) phân lập từ phôi chuột cho thấy các dịch chiết thu được không gây độc cho dòng tế bào lành
này. Điều này cho thấy dịch chiết lá đu đủ có triển vọng trở thành một trong những nhóm chất có thể điều trịbệnh ung thư ởmột số trường hợp nhất định.
Theo PGS.TS ĐỗThị Hoa Viên, HồThịHà thuộc Viện Công nghệSinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, tiến hành nghiên cứu và chiết xuất và bước đầu khảo sát hoạt tính kích thích miễn dịch và độc tính cấp của một sốdịch chiết lá đu đủCarica Papaya L. Trong nghiên cứu này đã nghiên cứu quy trình công nghệvới các thông sốthích hợp đểchiết các chất phân cực, flavonoid, saponin và alkaloid từ lá đu đủ (Carica papaya). Hàm lượng các nhóm chất trong lá đu đủ (tính theo % nguyên liệu khô) giảm dần từ các chất phân cực, alkaloid, flavonoid và
saponin; hàm lượng ương ứng của các nhóm chất trên là 6,02%; 3,40%; 1,67% và 0,11%. Trong bốn nhóm chất (các chất phân cực, alkaloid, flavonoid và saponin) đã thửnghiệm hoạt tính kích thích miễn dịch thông qua khả năng kích thích sự phát triển
của tế bào lymphocyte lách chuột, chỉ có nhóm các chất phân cực và saponin là có hoạt tính. SD50 (liều kích thích 50% sựphát triển của tếbào lymphocyte) của các chất phân cực và saponin tương ứng là 287,87 và 192,99g/ml. Các chất phân cực và các alkaloid chiết xuất từ lá đu đủ khô không có độc tính cấp với chuột ở liều đã thử
nghiệm (10000 mg hoạt chất/kg thểtrọng) [3,4].
Theo Đỗ Sơn Tùng, Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm,
Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, tiến hành nghiên cứu chiết xuất một số hợp phần từ lá đu đủCarica papaya L. và khảo sát hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các phân
đoạn chất chiết. Cao chiết tổng được chiết bằng methanol sau đó chiết phân đoạn bằng
các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, dicloromethan, ethyl acetate, n-
butanol. Sau đó tác giảtiến hành thửhoạt tính gây độc tế bào và định tính hợp chất tự
nhiên trong các phân đoạn cao chiết thu được. Khảo sát hoạt tính gây độc tế bào ung
thư của các phân đoạn chất chiết trên các dòng tếbào tế bào ung thư: KB (ung thư biểu mô), tế bào ung thư LU –1 (ung thư phổi), dòng tế bào ung thư Hep – G2 (ung thư
gan). Kết quả thử nghiệm cho thấy phân đoạn chiết bằng dung môi diclorometan có hoạt tính trên cả 3 dòng tế bào ung thư. Dòng tếbào Hep – G2 (ung thư gan) thểhiện hoạt tính ở phân đoạn chiết bằng dung môi n – hexan. Phân tích định tính hợp chất flavonoid có trong phân đoạn ethyl acetate, hợp chất alkaloid có trong phân đoạn diclorometan [20].
CHƯƠNG II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
II.1. Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị II.1.1. Nguyên liệu
Cây Đu đủ (Carica papaya L.) giống đu đủ Đài Loan, được trung tâm giống
cây ăn quả - Trường Đại Học Nông nghiệp I - Hà Nội nhập hạt và nhân giống. Cây
được trồng tại Nam Hồng - Đông Anh - Hà Nội. Lá thu hái vào tháng 10 năm 2012.
Hái lá bánh tẻ, lá không sâu bệnh, không dập nát.
Sau khi thu hái lá đu đủ tươi ta tiến hành sấy khô nguyên liệu thu hái bằng
phương pháp sấy thường ở nhiệt độ400C - 500C. Các mẫu tươi đều được làm khô đến
độ ẩm 10,3% và xay nhỏ lọt qua sàng có đường kính lỗ sàng 1,0 mm. Bột lá được
đóng gói kín trong túi nilon tối màu, bảo quản trong tủ lạnh ở khoảng nhiệt độ 00C - 50C.
II.1.2. Hóa chất
- DPPH (1,1- Diphenyl 1-2 picrylhydrazyl) (sigma, Mỹ) -Nước cất 2 lần bằng máy A4000D (Bibby Scientific, Anh)
-DMSO (Merck, Đức)
- Ethanol 80%.
- Đệm KH2PO4, K2HPO4 50mM, pH7.8
- Xanthine oxydase 0.02U (Grade IV, butter milk) - Xanthine 0.5mM
- NBT 0.05mM (Nitro Blue Tetrazolium chloride) - DMSO (Merk)
II.1.3. Thiết bị, dụng cụ
-Cân điện tử
- Máy cô quay chân không (rotavapor) - Máy sấy thường
- Cân phân tích
- Bình tam giác, cốc đong
- Giấy lọc
- Bình chiết ( bình chiết hình quảlê)
-Máy đọc ELISA Bio-Rad (Laboratories,Mỹ) - Bể ổn nhiệt, thiết lậpở25oC , 37oC
- Micropipet loại 10 μL, 20 μL, 200 μL, 1000 μL (Isolab, Đức) -Đầu côn 20μL, 200 μL, 1000 μL
- Phiến 96 giếng (SPL Life Sciences, Hàn Quốc).
II.2.Phương pháp nghiên cứu
II.2.1. Phương pháp chiết xuất hợp chất tựnhiên từthực vật
Chiết xuất là phương pháp sửdụng dung môi đểlấy các chất hòa tan ra khỏi các mô thực vật. Sản phẩm thu được của quá trình chiết xuất là một dung dịch của các chất hòa tan trong dung môi. Dung môi nàyđược gọi là dịch chiết. Có ba quá trình quan trọng đồng thời xảy ra trong chiết xuất là:
Sựhòa tan của chất tan vào dung môi
Sựkhuếch tán của chất tan trong dung môi
Sựdịch chuyển của các phân tửchất tan qua vách tếbào thực vật
Các yếu tố ảnh hưởng đến ba quá trình này (bản chất của chất tan, dung môi, nhiệt độ, áp suất, cấu tạo của vách tế bào…) sẽ quyết định chất lượng và hiệu quảcủa
Nguyên liệu trước khi chiết xuất cần kiểm tra vềmặt thực vật xem có đúng loại, cần ghi rõ nơi thu hái, thời gian thu hái. Tùy theo trường hợp mà đặt vấn đềvềthời vụ thu hái, để đảm bảo hoạt chất mong muốn có hàm lượng cao nhất. Mẫu nguyên liệu
được làm khô hoặc để tươi đểchiết. Nhiều hoạt chất rắn rất dễbiếnđổi trong quá trình làm khô hoặc ngay khi còn tươi nếu không xử lý để diệt enzym. Kích thước của bột nguyên liệu cũng là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến chất lượng và hiệu quả của quá trình chiết.
Dung môi chiết cũng tùy theo từng loại hoạt chất mà chọn cho thích hợp. Về
nguyên tắc, để chiết các chất phân cực (các glycoside, các muối của alkaloid, các hợp chất polyphenol…) thì phải sử dụng các dung môi phân cực. Để chiết các chất kém phân cực (chất béo, tinh dầu, carotenoid, các triterpene và streroid tự do…) thì phải sử
dụng các dung môi kém phân cực. Trên thực tế, cồn với các độ cồn khác nhau là dung
môi hay được dùng để chiết. Còn có thể hòa tan được nhiều nhóm hoạt chất, không
độc, rẻ tiền và dễ kiếm. Trong một vài trường hợp mẫu được thả từ từ trong cồn sôi vừa để dịch enzym vừa đểhòa tan hoạt chất.
Có rất nhiều kỹ thuật và thiết bị chiết khác nhau được áp dụng cho hai phương
pháp chiết như trên như: chiết ở nhiệt độ thường (ngâm lạnh, ngâm kiệt ở nhiệt độ thường) hay nhiệt độ cao (chiết nóng, hãm, sắc, ngâm kiệt nóng); chiết với các thiết bị
Soxhlet, kumagawa… tùy yêu cầu, điều kiện mà chọn kỹthuật chiết thích hợp.
Trong điều kiện chiết xuất, dựa vào trạng thái của nguyên liệu và đặc tính của dung môi chiết xuất, người ta chia chiết xuất thành 2 loại.
Chiết xuất tĩnh: là trong suốt quá trình chiết xuất nguyên liệu và dung môi
không được đảo trộn. Nguyên liệu được ngâm trong dung môi trong một thời gian nhất định trong suốt quá trình chiết xuất.
Chiết xuất động: dung môi và nguyên liệu chuyển động hoặc cả hai cùng chuyển động nhờcánh khuấy làm tăng khả năng tiếp xúc, nhờ đó hiệu suất chiết xuất cao sẽ hơn.
II.2.1.1. Phương pháp ngâm dầm trong dung môi
Nguyên liệu đã làm nhỏtới độ thích hợp và dung môi được chứa vào một bình
kín để ở nhiệt độ phòng. Ngâm trong thời gian xác định, thỉnh thoảng có khuấy trộn hoặc lắc.
Sau đó gạn, ép bã lấy dịch chiết xuất. Đểlắng 24–36 tiếngởnhiệt độphòngđể
loại bỏ tạp chất lơ lửng. Gạn, lọc lấy dịch trong, có thể ngâm đơn giản hoặc ngâm
phân đoạn.
Ngâm dầm đơn giản: ngâm một lần với toàn bộ lượng nguyên liệu trong dung môi.
Ngâm dầm phân đoạn: chia dung môi ra làm nhiều phần rồi ngâm làm nhiều lần với nguyên liệu, sau mỗi lần ngâm thì tiến hành gạn lấy dịch chiết xuất, ép bã, lại cho dung môi mới vào ngâm và tiếp tục tiến hành như trên, các phần dịch chiết xuất được tập hợp lại được gọi là dịch chiết xuất.
Với phương pháp này, cùng lượng dung môi sẽchiết xuất được hàm lượng hoạt chất nhiều hơn so với phương pháp ngâm dầm đơn giản. Phương pháp ngâm dầm lạnh
dùng cho các dược liệu chứa hoạt chất dễtan hoặc dễbị phân hủyởnhiệt độcao.
Ưu điểm:
Phương pháp ngâm dầm trong dung môi là phương pháp dễthực hiện
Dụng cụthí nghiệm đơn giản
Chí phí thí nghiêm thấp
Nhược điểm:
Để đạt được hiệu suất chiết cao thì phải chiết làm nhiều lần với thời gian chiết
tương đối dài
Các bước thực hiện:
Bước 1: cân 30g nguyên liệu cho vào bình tam giác 500ml, tiếp theo lấy dung môi etanol 80% theo tỷ lệ khảo sát (1/5, 1/6, 1/7) cho vào bình,đậy nút nhám,
quấn giấy bạc, ngoài lớp quấn giấy bạc quấn bằng dây để cố định giấy bạc (chống bay hơi dung môi).
Bước 2: Cho bình tam giác vào tủ lắc ở điều kiện khảo sát (nhiệt độ: 30oC, 35oC, 40oC; thời gian: 24h, 36h, 48h; tỷlệnguyên liêu/dung môi: 1/5, 1/6, 1/7) , tốc độlắc 120 vòng/phút.
Bước 3: Lọc dịch chiết bằng giấy lọc thu dịch chiết.
Bước 4: Cô quay chân không dịch chiếtđến kiệt dung môi thu cao chiết.
Bước 5: Sấy cao chiết ở nhiệt độ 50oC đến trọng lượng không đổi, cân và tính
lượng cao chiết thu được.
II.2.1.2.Phương pháp chiết xuấtSoxhlet
Chuẩn bị nguyên liệu, bọc giấy, bịt kín hai đầu rồi đặt vào trụchiết xuất. Dùng dung môi chiết xuất trong một thời gian nhất định. Sau khi thực hiện các chu trình chiết xuất lấy dịch chiết xuất đem ra cô chân không thu được cao chiết.
Ưu điểm:
Phương pháp này có ưu điểm là chiết xuất được kiệt hoạt chất có trong nguyên liệu
Thời gian chiết được rút ngắn
Dụng cụthí nghiệm đơn giản
Nhược điểm
Phương pháp này có nhược điểm là dưới tác dụng của nhiệt độthì các hoạt chất dễbịmất hoạt tínhởnhiệt độcao
Các bước thực hiện:
Bước 1: Cân 10g nguyên liệu, bọc giấy lọc và quấn dây chỉ giữkhỏi bung. Lắp ráp hệ thống Soxhlet, đổ 200ml Etanol vào bình cầu 500ml, 50ml etanol và nguyên liệu lên bình chiết.
Bước 3: Theo dõi thời gian hoạt động của hệ thống (2h,4h,6h,8h) để kết thúc quá trình chiết.
Bước 4: Kết thúc quá trình chiết: tắt bếp, thu dịch chiết.
Bước 5: Cô quay chân không dịch chiết thu cao chiết.
Bước 6: Sấy cao chiết ở nhiệt độ 50oC đến trọng lượng không đổi và cân tính
lượng cao thu được.
II.2.2.Phương pháp chiết phân đoạn bằng dung môi có độphân cực tăng dần
Về nguyên tắc, để chiết các chất phân cực (các glycoside, các muối của alkaloid, các hợp chất polyphenol…) thì phải sử dụng các dung môi phân cực. Để
chiết các chất kém phân cực (chất béo, tinh dầu, carotenoid, các triterpen và streroid tự do…) thì phải sửdụng các dung môi kém phân cực. Trên thưc tế, cồn với các độ cồn
khác nhau là dung môi hay được dùng. Cồn có thể hòa tan được nhiều hoạt chất,
không độc, rẻtiền và dễkiếm.
Trong một vài trường hợp, dược liệu tươi được thả từ từ trong cồn sôi vừa để
diệt enzim vừa để hòa tan hoạt chất. Tiếp theo đó ta có thể dùng các dung môi có độ
phân cực tăng dần để chiết phân đoạn như: n – hexan D = 0, diclorometan D =1,04 hoặc cloroform, ethyl acetate D = 1,78, n – butanol D = 1,63… (D là momen phân
cực).
Các bước thực hiện:
Bước 1: Chiết cao tổng số
Tiến hành chiết xuất trong điều kiện tối ưu như đã xác định được ở các thí nghiệm trên như sau:
Nguyên liệu ban đầu: 100g
Dung môi chiết xuất: ethanol 80%
Tỷlệnguyên liệu/dung môi: 1/6
Thời gian chiết xuất: 48 giờ
Sau khi chiết xuất trong điều kiện thích hợp ta thu lượng cao chiết và mang đi
cô cạn dung môi thu cao chiết tổng.
Bước 2: pha cao chiết tổng thu được với nước cất: tỷlệ1:1 (thu được dung dịch chiết).
Bước 3: chiết phân đoạn bằng các dung môi chiết: n-hexan, diclorometan , ethyl acetate, n-butanol , với tỷ lệ dung dich chiết và dung môi 1:1 (Chiết làm 3 lần
đểhòa tan hết các chất).
Bước 4:các phân đoạn chiết thu được sau đó đem cô quay chân không để loại bỏdung môi thu cao chiết ởmỗi phân đoạn chiết.
Bước 5: Sấy cao chiết thu được ở nhiệt độ 50oC đến trọng lượng không đổi thu cao chiết từng phân đoạn.
II.2.3. Phương pháp phân tích định tính Carotenoid và saponin II.2.3.1. Phân tích định tính carotenoid
Định tínhbằng thuốc thử
Phảnứng dùng theo lý thuyết:
Lấy khoảng 10 mL dịch chiết ete cho vào chén sứ, bốc hơi tới cao. Thêm vào cao vài giọt SbCl3 (khan) bão hòa trong clorofoc (thuốc thửCarr-Price). Dung dịch có màu xanh chuyển sang màu đỏ: có carotenoid.
Lấy khoảng 10 mL dịch chiết ete cho vào chén sứ, bốc hơi tới cao. Thêm vào cao vài giọt H2SO4 đậm đặc. Dung dịch có màu xanh dương đậm hay màu lục ngả sang màu xanh dương: có carotenoid.
Phảnứng thực nghiệm:
Lấy khoảng 20 mg cao mẫu từng phân đoạn cho vàoống nghiệm. Thêm vào đó
vài giọt thuốc thử Car-Price thấy dung dịch xuất hiện màu đỏ thì cao có chứa carotenoid.
Lấy khoảng 20 mg cao mẫu từng phân đoạn cho vàoống nghiệm. Thêm vào đó
vài giọt H2SO4 đậm đặc thấy dung dịch xuất hiện màu xanh lục đậm thì cao có chứa