4. Bố cục đề tài
1.4.3. Tình hình kháng kháng sinh
Kháng kháng sinh là khả năng của một vi sinh vật (như vi khuẩn, vi rút và một số ký sinh trùng) ngăn chặn một loại thuốc chống vi trùng (như kháng sinh, thuốc chống vi rút và thuốc chống sốt rét) hoạt động chống lại nĩ. Do đĩ, các phương pháp điều trị tiêu chuẩn trở nên khơng hiệu quả, nhiễm trùng vẫn tồn tại và cĩ thể lây sang người khác. Sử dụng kháng sinh cĩ thể dẫn đến kháng thuốc. Việc phát hiện ra kháng sinh là một phát minh vĩ đại của nền y học thế giới, nĩ đã cứu được hàng triệu người trên thế giới. Nhưng ngày nay càng ngày càng cĩ nhiều loại vi khuẩn kháng lại các loại kháng sinh từng tấn cơng, tiêu diệt được nĩ. Điều này đã gây ra rất nhiều khĩ khăn trong việc tiêu diệt nĩ lần nữa vì mỗi loại vị khuẩn sẽ cĩ sự đáp ứng tương tự với mỗi loại kháng sinh khác nhau. Vậy tại sao lại xuất hiện hiện tượng vi khuẩn kháng thuốc này?
Tình trạng kháng thuốc kháng sinh xảy ra khi một loại sinh vật tiến hĩa để đề kháng mạnh hơn hoặc hồn tồn chống lại kháng sinh mà trước đây từng trị được.
Sự đề kháng này về cơ bản là do bộ gen của vi khuẩn, tức là vi khuẩn tự nhiên xuất hiện các gen kháng thuốc trong tế bào. Sự xuất hiện gen kháng thuốc này cĩ thể cĩ do 3 cách là đề kháng tự nhiên, đột biến gen hoặc cĩ sức đề kháng được chuyển từ một lồi khác.
Mỗi lần bạn dùng thuốc kháng sinh, vi khuẩn nhạy cảm sẽ bị tiêu diệt. Nhưng vi trùng kháng thuốc cĩ thể cịn lại để phát triển và nhân lên. Họ cĩ thể lây lan sang người khác. Chúng cũng cĩ thể gây nhiễm trùng mà một số loại kháng sinh khơng thể chữa khỏi.
Cơ chế của đề kháng kháng sinh cĩ thể được hiểu đơn giản như sau: khi người bệnh sử dụng kháng sinh, thuốc kháng sinh sẽ tác động trên một hay nhiều bộ phận của tế báo vi khuẩn và tiêu diệt gần như tất cả các loại vi khuẩn, trừ một số loại cĩ khả
năng kháng thuốc. Vi khuẩn đề kháng kháng sinh bằng cách thay đổi các đặc tính ( cấu trúc hay chuyển hố …) của các bộ phận của tế báo vi khuẩn làm cho kháng sinh khơng cịn tác dụng giết chết vi khuẩn , sinh ra kháng thuốc. Những vi khuẩn kháng thuốc này tiếp tục phát triển, nhân lên, phát tán và lây nhiễm những người khác khiến thuốc kháng sinh dần mất tác dụng, gây ra tình trạng đề kháng thuốc [12].
Nguyên nhân gây ra đề kháng kháng sinh bao gồm kê toa kháng sinh khi khơng cần thiết và bệnh nhân khơng tuân thủ điều trị, lạm dụng kháng sinh trong chăn nuơi, hệ thống vệ sinh yếu kém, kiểm sốt nhiễm khuẩn trong bệnh viện và phịng khám chưa tốt, chưa cĩ kháng sinh mới.
Kháng kháng sinh đang tăng lên mức cao nguy hiểm ở tất cả các nơi trên thế giới. Các cơ chế kháng thuốc mới đang xuất hiện và lan rộng trên tồn cầu, đe dọa khả năng điều trị các bệnh truyền nhiễm thơng thường.
Kháng kháng sinh cĩ mặt ở khắp mọi nơi và cĩ khả năng ảnh hưởng đến bất kỳ ai, ở mọi lứa tuổi, ở mọi quốc gia. Bệnh nhân bị nhiễm trùng do vi khuẩn kháng thuốc cĩ nguy cơ tăng kết quả lâm sàng và tử vong tồi tệ hơn, và tiêu thụ nhiều tài nguyên chăm sĩc sức khỏe hơn so với bệnh nhân bị nhiễm các chủng vi khuẩn khơng kháng cùng loại.
Tình trạng kháng kháng sinh của các vi khuẩn gây bệnh, đặc biệt là các vi khuẩn Gram âm như E.coli, Klebsiella spp, P.aeruginosa, A.baumannii đang là gánh nặng cho khơng những người bệnh mà cho tồn xã hội, vì sự gia tăng chi phí khi thay thế các kháng sinh cũ bằng kháng sinh mới. Những vi khuẩn Gram âm này ngày càng thể hiện tính kháng với nhĩm carbapenem và cephalosporin thế hệ 3, là những kháng sinh được dùng để điều trị vi khuẩn đa kháng thuốc [12].
Tình trạng kháng E.coli đối với một trong những loại thuốc được sử dụng rộng rãi nhất để điều trị nhiễm trùng đường tiết niệu (kháng sinh fluoroquinolone) là rất phổ biến. Cĩ nhiều quốc gia ở nhiều nơi trên thế giới mà việc điều trị này hiện khơng hiệu quả ở hơn một nửa số bệnh nhân.
Kháng thuốc hàng đầu để điều trị nhiễm trùng do Staphlylococcus aureus Sica gây ra nhiễm trùng nghiêm trọng tại các cơ sở y tế và cộng đồng cộng đồng là phổ biến. Những người bị MRSA ( Staphylococcus aureus kháng methicillin ) được ước tính cĩ nguy cơ tử vong cao hơn 64% so với những người cĩ dạng nhiễm trùng khơng kháng thuốc.
Kháng kháng sinh cĩ khả năng ảnh hưởng đến mọi người ở bất kỳ giai đoạn nào của cuộc sống, cũng như các ngành cơng nghiệp chăm sĩc sức khỏe, thú y và nơng
nghiệp, khiến nĩ trở thành một trong những vấn đề sức khỏe cộng đồng cấp bách nhất trên thế giới.
Mỗi năm ở Mỹ, ít nhất 2,8 triệu người bị nhiễm vi khuẩn hoặc nấm kháng kháng sinh và hơn 35.000 người tử vong.
Khơng ai cĩ thể hồn tồn tránh được nguy cơ nhiễm trùng kháng thuốc, nhưng một số người cĩ nguy cơ cao hơn những người khác (ví dụ, những người mắc bệnh mãn tính). Nếu kháng sinh mất hiệu quả, thì chúng ta sẽ mất khả năng điều trị nhiễm trùng và kiểm sốt các mối đe dọa sức khỏe cộng đồng [19].
Kháng sinh là một thành tựu quan trọng của thế kỷ 20. Sự ra đời của kháng sinh là một bước ngoặt lớn của y học, giúp giảm thiểu đáng kể tỷ lệ mắc bệnh và tử vong do nhiễm khuẩn. Tuy nhiên việc lạm dụng kháng sinh đã gây ra tình trạng kháng kháng sinh ngày càng nghiêm trọng và trở thành vấn đề mang tính tồn cầu.
Bên cạnh đĩ cho đến nay mặc dù các thế hệ thuốc kháng sinh mới đang được nghiên cứu, nhưng trên thực tế vẫn chưa được thử nghiệm lâm sàng. Sự gia tăng các chủng vi khuẩn đa kháng trong bối cảnh nghiên cứu phát triển kháng sinh mới ngày càng hạn chế làm cho việc điều trị các bệnh lý nhiễm khuẩn ngày càng khĩ khăn và nguy cơ khơng cịn kháng sinh để điều trị nhiễm khuẩn trong tương lai [7].
Một số nghiên cứu dịch tễ tại Việt Nam gần đây hơn cho thấy tỷ lệ vi khuẩn Gram âm kháng thuốc đang cĩ xu hướng gia tăng nhanh chĩng. Theo báo cáo về cập nhật kháng kháng sinh ở Việt Nam của tác giả Đồn Mai Phương trình bày tại Hội nghị khoa học tồn quốc của Hội hồi sức cấp cứu và chống độc Việt Nam năm 2017, vi khuẩn Gram âm kháng thuốc đã xuất hiện trên cả nước. Căn nguyên chính phân lập được là E.coli, K. pneumoniae, A. baumannii và P.aeruginosa. Vi khuẩn A. baumannii
và P. aeruginosa cĩ tỷ lệ đề kháng cao nhất, cĩ những nơi đề kháng tới trên 90%. Đồng thời, các nhĩm vi khuẩn này đã mang hầu hết các loại gen mã hĩa kháng thuốc [14].
Kháng kháng sinh là một vấn đề phức tạp ảnh hưởng đến tất cả xã hội và được thúc đẩy bởi nhiều yếu tố liên kết với nhau. Việc quản lý sử dụng kháng sinh hợp lý đã trở thành vấn đề cĩ tính cấp thiết, địi hỏi các nhà quản lý ở các nước phát triển cũng như các nước đang phát triển phải vào cuộc. Hành động phối hợp là cần thiết để giảm thiểu sự xuất hiện và lan truyền của kháng kháng sinh.
CHƯƠNG 2
ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, PHẠM VI VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu
- Nguyên liệu thực vật
Đối tượng nghiên cứu là cây thuốc Thượng(Phaeanthus vietnamensis Ban). Lá cây thuốc Thượng dùng trong nghiên cứu được cung cấp bởi bệnh viện Y học Cổ truyền thành phố Đà Nẵng, địa điểm thu hái tại huyện Quế Sơn, tỉnh Quảng Nam.
- Chủng vi khuẩn
3 chủng vi khuẩn dùng để khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết thuốc Thượng, bao gồm 2 chủng vi khuẩn Gram âm: Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli và 1 chủng vi khuẩn Gram dương Staphylococcus aureus. Các chủng vi khuẩn được cung cấp bởi Khoa Vi sinh lâm sàng - Bệnh viện C Đà Nẵng.
- Động vật thí nghiệm
Chuột nhắt trắng đực (6 tuần tuổi) được cung cấp bởi Viện Vắc xin và Sinh phẩm Y tế - IVAC được nuơi trong cùng điều kiện, cùng chế độ dinh dưỡng trong suốt quá trình nghiên cứu tại phịng thí nghiệm Cơng nghệ sinh học và Giải phẫu sinh lý người và động vật, khoa Sinh – Mơi trường, Đại học Sư phạm Đà Nẵng.
2.2. Nội dung nghiên cứu
- Nội dung 1: Nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn của cao chiết lá thuốc Thượng trên 3 chủng vi sinh vật kiểm định gây bệnh người bao gồm Escherichia Coli, Staphylococus aureus, Pseudomonas aeruginosa.
- Nội dung 2: Nghiên cứu tác dụng kháng viêm của cao lá thuốc Thượng trên mơ hình chuột nhắt trắng gây viêm phổi- dị ứng.
2.3. Phạm vi nghiên cứu
- Thí nghiệm được tiến hành tại phịng thí nghiệm Cơng nghệ sinh học và phịng thí nghiệm Giải phẫu sinh lý người và động vật, khoa Sinh – Mơi trường, Đại học Sư phạm Đà Nẵng.
- Về khả năng kháng viêm của cao chiết lá cây thuốc Thượng, thí nghiệm nghiên cứu trên mơ hình chuột nhắt trắng viêm phổi gây bởi OVA.
- Về khả năng kháng khuẩn của cao chiết lá cây thuốc Thượng, thí nghiệm nghiên cứu trên 3 chủng vi sinh vật kiểm định gây bệnh trên người là Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Escherichia coli.
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp điều chế cao chiết từ nguyên liệu thực vật
Mẫu lá thuốc Thượng được thu hái tại huyện Quế Sơn, tỉnh Quảng Nam. Chọn lá khơng quá non và quá già. Loại bỏ các cành nhỏ.
Mẫu sau khi thu hái được sàng lọc loại bỏ những lá sâu bệnh và được sấy khơ tự nhiên. Sau đĩ lá được nghiền mịn thành bột và bảo quản lạnh trong lọ kín cho đến khi sử dụng.
Mẫu nghiền mịn được chiết theo phương pháp đun hồi lưu Quy trình chiết cao được thực hiện như sơ đồ 2.1
Sơ đồ 2.1. Sơ đồ chiết cao từ lá cây thuốc Thượng
Đun hồi lưu, Ethanol 70o, To 70oC, 3h
Cơ quay, 90 bar, To 50oC, 1h45’ Sấy khơ 60 oC, 72h Xay mịn, Rây lưới 0,5mm Bảo quản To -4oC
2.4.2. Phương pháp xác định một số hợp chất từ cao chiết
Cao chiết được xử lý với máy sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) tại trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn đo lường chất lượng 2 (Quatest 2) để xác định các hợp chất cĩ trong cao chiết. Kết quả phân tích được đính kèm ở phần phụ lục 3.
2.4.3. Phương pháp nuơi cấy vi khuẩn và xác định hoạt tính kháng khuẩn a. Chuẩn bị mơi trường nuơi cấy a. Chuẩn bị mơi trường nuơi cấy
Dụng cụ: Ống nghiệm, giá để ống nghiệm, đĩa petri, bình tam giác 250 ml, cốc thủy tinh 250 ml, pipet các loại, ống đong, phễu thủy tinh, giấy lọc, giấy bao gĩi, bơng khơng thấm nước, bơng y tế, đèn cồn.
Mơi trường nuơi cấy LB
Cân chính xác các thành phần trong mơi trường bằng cân kĩ thuật, pha với nước cất, xong cho vào lị vi sĩng nấu tan agar. Điều chỉnh pH bằng dung dịch kiềm. Đổ vào chai 500ml bọc giấy bạc, cho vào nồi hấp. Đợi 1h30’ đổ mơi trường ra đĩa petri.
- Các vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Staphylococcus aureus được nuơi cấy trên mơi trường LB. Cơng thức pha chế mơi trường được minh họa trong bảng 2 phần phụ lục.
- Kháng sinh đồ được thực hiện trên mơi trường thạch Mueller Hinton (MHA). Cơng thức pha chế mơi trường được minh họa trong bảng 1 phần phụ lục.
b. Phương pháp nuơi cấy vi khuẩn
Mẫu vi khuẩn sau khi lấy về từ đơn vị cung cấp, được cấy chuyển ngay trong vịng 24 giờ để đảm sức sống vi khuẩn và tính chính xác của thí nghiệm thử hoạt tính. Quá trình nuơi cấy được thực hiện trong mơi trường LB. Dùng que cấy vơ trùng nhúng vào dịch mẫu để cĩ các vi khuẩn muốn nuơi cấy. Ria các đường trên đĩa petri cĩ chứa mơi trường thạch thích hợp, sau đĩ quay 1800 và ria lại . Sau mỗi đường ria liên tục, đốt khử trùng que cấy và làm nguội trước khi thực hiện thao tác tiếp theo. Lật ngược đĩa và ủ trong tủ ấm trong 24h -72h.
c. Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn
Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của dịch chiết được xác định bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch của Hadacek và cộng sự (2000). Theo đĩ, hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được đánh giá bằng cách đo đường kính vịng ức chế vi sinh vật (ĐK) theo cơng thức ĐK (mm) = D – d, với D là đường kính vịng vơ khuẩn và d là đường kính lỗ chứa dịch cao chiết hoặc khoanh giấy kháng sinh. Dịch chiết hoặc kháng sinh ở trong khoanh giấy sẽ khuếch tán vào thạch cĩ chứa các chủng vi khuẩn thử nghiệm và mức độ nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh được biểu hiện bằng đường kính các vịng vơ khuẩn xung quanh khoanh giấy kháng sinh [11]. Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần và lấy giá trị trung bình để xác định đường kính vịng ức
chế.
Cách tiến hành: Cho vào mỗi đĩa 25 ml mơi trường LB vơ trùng. Mỗi đĩa peptri đục 6 giếng thạch với đường kính 3 mm gồm:
- 4 giếng chứa 100µl dịch cao chiết từ lá thuốc Thượng với các nồng độ lần lượt là 100, 200, 400, 600, 800 mg/ml.
- 1 giếng chứng 100µl DMSO 5% vơ trùng
- 1 giếng chứa kháng sinh đối chứng đặt ở trung tâm.
Các đĩa mẫu chứa 3 chủng vi khuẩn gồm: Escherichia coli, Staphylococcus aureus và Pseudomonas aeruginosa.
Để vào tủ lạnh 5 – 10 giờ cho kháng sinh, dịch chiết được khuếch tán rồi nuơi cấy ở nhiệt độ 28-300 C. Đọc kết quả sau 24 giờ.
d. Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC)
Hút 0,2 ml dịch vi khuẩn nồng độ đã được chọn từ trước vào ống nghiệm chứa mơi trường LB lỏng, hút thêm 0,2 ml nước cất vơ trùng vào ống nghiệm cĩ chứa mơi trường nuơi cấy và dịch vi khuẩn. Lắc kỹ ống nghiệm. Nuơi hỗn hợp trên trong vịng 24 giờ ở 37°C.
Chọn nồng độ pha lỗng thích hợp của các chủng vi khuẩn, hút 0,2 ml dịch vi khuẩn vào ống nghiệm chứa mơi trường nuơi cấy lỏng, hút thêm 0,2 ml dịch cao chiết vào ống nghiệm cĩ chứa mơi trường nuơi cấy và dịch vi khuẩn phân phối từ nồng độ cao chiết từ thấp nhất đến nồng độ cao nhất. Lắc kỹ từng ống nghiệm. Hút 0,1 ml dịch trong mỗi ống nghiệm cấy trang lên đĩa thạch chứa mơi trường LB rắn và tiếp tục đặt vào tủ ấm 37 °C trong 24 giờ.
Nuơi hỗn hợp ở các ống nghiệm trên trong vịng 12 giờ quan sát độ đục từng ống nghiệm. Chú ý quan sát ống nghiệm chứa chứng âm trước nếu thấy chủng vi khuẩn phát triển tốt mới tiếp tục cấy, nếu khơng phải làm lại thí nghiệm.
Đọc kết quả: Đếm số khuẩn lạc cĩ trên đĩa thạch chứa mơi trường LB. Đĩa cĩ số khuẩn lạc 1-3 khuẩn lạc/đĩa là đĩa cĩ nồng độ tối thiểu của cao chiết ức chế sự phát triển của vi khuẩn (MIC). Những đĩa khơng khơng cĩ sự phát triển của khuẩn lạc với nồng độ gần nồng độ ức chế tối thiểu nhất được xác định là đĩa chứa nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC).
2.4.4. Phương pháp thử nghiệm cao chiết trên mơ hình chuột viêm-dị ứng phổi phổi
a. Thiết lập mơ hình hen suyễn và điều trị
Mơ hình thí nghiệm được mơ tả như sơ đồ 2.2.
(1) Nạve: nhĩm đối chứng sinh lý (2) OVA: đối chứng âm
(3) PVE50: điều trị bằng PVE liều lượng 50 mg/kg trọng lượng cơ thể chuột
(4) PVE100: điều trị bằng PVE liều lượng 100 mg/kg trọng lượng cơ thể chuột
(5) PVE200: điều trị bằng PVE liều lượng 200 mg/kg trọng lượng cơ thể chuột
(6) Dex: đối chứng dương
Chuột ở các nhĩm 2, 3, 4, 5, 6 được tiến hành gây bệnh:
+ Tiêm (sensitization) màng bụng lần đầu vào ngày 1, lần 2 vào ngày 14 của đợt thí nghiệm.
+ Xơng hơi đường mũi (challenge) từ ngày 27 đến ngày 29 bởi ovalbumin (OVA) 5% 1 lần trong ngày.
Sau gây bệnh, chuột được điều trị liên tiếp trong 12 ngày (từ ngày 15 đến ngày